中華鱉蛋白質(zhì)組分的分步提取及其抗氧化活性

劉 彥，劉承初,*，楊靖亞，劉其根，李應(yīng)森，李家樂,3

(1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306；2.上海海洋大學(xué) 省部共建水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海201306；3.上海市高校水產(chǎn)養(yǎng)殖學(xué)E-研究院，上海 201306)

中華鱉蛋白質(zhì)組分的分步提取及其抗氧化活性

劉 彥1，劉承初1,*，楊靖亞1，劉其根2，李應(yīng)森2，李家樂2,3

(1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306；2.上海海洋大學(xué) 省部共建水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海201306；3.上海市高校水產(chǎn)養(yǎng)殖學(xué)E-研究院，上海 201306)

以野生中華鱉全鱉粉為原料，采用分步提取法對(duì)中華鱉的蛋白類成分進(jìn)行分離，并利用等電點(diǎn)沉淀、醇沉、超過濾等方法分離純化出各蛋白質(zhì)組分，并對(duì)其各組分的抗氧化性進(jìn)行研究，并對(duì)抗氧化活性高的組分進(jìn)行分子質(zhì)量測(cè)定分析；還原力的測(cè)定以還原劑BHT為對(duì)照，清除DPPH自由基能力的測(cè)定則進(jìn)行直線回歸分析并計(jì)算 IC50值。結(jié)果表明：糖蛋白組分及水溶性蛋白組分抗氧化活性較高，IC50值為0.21mg/mL和1.94mg/mL。因此，中華鱉各蛋白組分有較高的抗氧化能力且呈顯著的劑量效應(yīng)關(guān)系，其在抗氧化方面和保健食品方面具有巨大的開發(fā)潛力。

中華鱉；分步提?。患兓?；氨基酸；抗氧化活性

Abstract：Protein fractions were separated and purifies from wild Chinese soft-shelled turtles using sequential extraction procedures and their antioxidant activities were investigated by DPPH free radical scavenging and reducing power assays. It was found that the glycoprotein and water-soluble protein fractions had higher antioxidant effect in a positive concentrationdependent fashion, with half maximal inhibitory concentrations (IC50) of 0.21 mg/mL and 1.94 mg/mL, respectively. These results suggest that the protein fractions from Chinese soft-shelled turtle possess strong antioxidant activities and have a great potential to be developed as a healthcare food or a nutriceutical.

Key words：Chinese soft-shelled turtle (Pelodiscus sinensis)；sequential extraction；purification；amino acids；antioxidant capability

中華鱉(Pelodiscus sinensis)學(xué)名鱉，又稱水魚、團(tuán)魚、黿魚、元魚、老鱉、王八，自古就是我國(guó)傳統(tǒng)食療滋補(bǔ)佳品。其具有豐富的蛋白質(zhì)，不但含有極高的膠原蛋白，而且富含18種氨基酸[1-2]。中華鱉具有許多生理功能，如抗氧化、提高機(jī)體免疫、促進(jìn)傷口愈合、滋陰、滋補(bǔ)、提高血漿蛋白含量、促進(jìn)造血功能、增強(qiáng)體力、清熱等，而這些活性均與抗氧化性質(zhì)有關(guān)[3-4]。中華鱉自2005年以來每年產(chǎn)量在14萬t以上，產(chǎn)值在50億元以上，其資源非常豐富，但目前關(guān)于中華鱉的研究報(bào)道很少，對(duì)其活性成分的研究還是空白。

本實(shí)驗(yàn)采用分步提取法對(duì)中華鱉的蛋白類成分進(jìn)行提取和純化，并對(duì)所獲各組分的蛋白質(zhì)含量及其抗氧化活性進(jìn)行研究，包括DPPH自由基的清除能力和還原能力，并對(duì)抗氧化性最佳的組分進(jìn)行氨基酸組成分析，以期為中華鱉活性成分的研究與藥物的開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

中華鱉 杭州天福生物科技有限公司；標(biāo)準(zhǔn)蛋白升正生物技術(shù)有限公司；除測(cè)氨基酸用的試劑為優(yōu)級(jí)純外，其他試劑均為市售分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

JD-600型9200超聲波細(xì)胞破碎機(jī)、UV-2000紫外可見分光光度計(jì) 尤尼柯(上海)儀器有限公司；IB-81型隔水恒溫培養(yǎng)箱 日本島津公司；FOSS Kjeltec 2300凱氏定氮儀 瑞典丹麥福斯集團(tuán)；DDY-2C型電泳儀 北京六一儀器廠； FR-200A電泳凝膠成像系統(tǒng) 美國(guó)UVP Geldot公司；蛋白質(zhì)純化系統(tǒng) 瑞典AKTAprime公司；FD-5型真空冷凍干燥機(jī)、CR 21G型臺(tái)式冷凍離心機(jī)、L-8800氨基酸全自動(dòng)分析儀 日本日立株式會(huì)社；81-2型恒溫磁力攪拌器 上海司樂儀器有限公司；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋 國(guó)華電器有限公司；精密電子天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 活性物質(zhì)的分離提取

活性物質(zhì)的提取流程如圖1所示。

圖1 中華鱉蛋白組分分步提取流程圖Fig.1 Procedures for sequential extraction of protein fractions from Chinese soft-shelled turtle(Pelodiscus sinensis)

1.3.2 分離組分的純化

將鱉粉提取出來的各組分樣品分別進(jìn)行純化，純化采用葡聚糖凝膠SephadexG-100柱層析法，將葡聚糖凝膠SephadexG-100充分溶脹抽氣后裝柱，柱型 1.6cm×50cm。用蛋白質(zhì)純化系統(tǒng)(瑞典AKTAprime System)進(jìn)行純化，緩沖液為去離子水，流速為 1mL/min，管速2min/管，以去離子水為洗脫劑，根據(jù)洗脫峰，分部收集，合并活性峰。洗脫后樣品經(jīng)透析袋(粒徑：14000μm)透析，自動(dòng)檢測(cè)并收集目的物，得純化后的各組分樣品。

1.3.3 分離組分蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

參照GB/T 5009.5—2003《食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》方法[5]。

1.3.4 分離組分抗氧化活性研究

1.3.4.1 分離組分蛋白還原力的測(cè)定

在10mL試管中分別加入不同質(zhì)量濃度樣品各1mL，0.2mol/L、pH6.6的磷酸鹽緩沖溶液2.5mL和1%鐵氰化鉀5mL，置于50℃水浴中20min后急速冷卻，加入10%的三氯乙酸5mL，于3000r/min離心10min，取上清液5mL，加入5mL蒸餾水和1mL 0.1%的三氯化鐵溶液，混勻后室溫下反應(yīng)10min，于700nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，反應(yīng)物的吸光度越高表明還原力越強(qiáng)[6-7]。

1.3.4.2 分離組分蛋白DPPH自由基清除率的測(cè)定

吸取不同質(zhì)量濃度的6組樣品各1mL，加0.025mg/mL的DPPH自由基甲醇溶液4mL。室溫下避光靜置1h后于波長(zhǎng)517nm[8-9]處測(cè)定吸光度。每份樣品平行操作3次，DPPH自由基的清除率通過下式計(jì)算。

式中：A0為DPPH自由基與溶劑混合液的吸光度；Ai為樣品與DPPH自由基反應(yīng)后的吸光度；Aj為樣品與溶劑混合液的吸光度。

實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，求得清除率的平均值。繪制清除率對(duì)質(zhì)量濃度曲線，計(jì)算出清除率為50%時(shí)的質(zhì)量濃度值，即為IC50值[10-11]。

1.3.5 分離組分蛋白的分子質(zhì)量測(cè)定

電泳：采用不連續(xù)聚丙烯S D S-酰胺凝膠電泳(PAGE)垂直板電泳法檢測(cè)甲魚分離蛋白的分子質(zhì)量[12-13]。電極緩沖液為25mmol/L Tris-192甘氨酸-0.1% SDS緩沖系統(tǒng)(pH8.3)。10%分離膠，5%濃縮膠，凝膠厚度為1.0mm。在8mA電流下電泳約2h，進(jìn)入分離膠后調(diào)電流至12.5mA，待溴酚藍(lán)染料前沿達(dá)分離膠底部時(shí)電泳結(jié)束。

顯色和脫色：染色液(0.1%考馬斯亮藍(lán)R-250，45%甲醇，10%冰醋酸)染色0.5h，再取出凝膠浸入脫色液(45%甲醇+9%醋酸)中脫色，直至凝膠本底色帶清晰。

掃描：用凝膠成像系統(tǒng)掃描凝膠。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：用卡尺測(cè)量溴酚藍(lán)和各種標(biāo)準(zhǔn)蛋白譜帶的遷移距離，溴酚藍(lán)染料遷移距離為5.9cm，Rm=標(biāo)準(zhǔn)蛋白(樣品)遷移距離(cm)/溴酚藍(lán)遷移距離(cm)。以標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的遷移率為橫坐標(biāo)，以其對(duì)應(yīng)的分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)繪圖，繪出已知分子質(zhì)量即標(biāo)準(zhǔn)蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線。然后根據(jù)未知樣品的遷移率，在曲線上查出其對(duì)應(yīng)的分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)，取其反對(duì)數(shù)即為分子質(zhì)量。蛋白質(zhì)分子質(zhì)量對(duì)數(shù)(y)與遷移率(x)的回歸方程為：y=5.1271－1.0283x(R2=0.9855)。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離組分的蛋白質(zhì)含量

各分離組分的蛋白質(zhì)含量分別為：組分1為2.203mg/mL，組分2為50.413mg/mL，組分3為20.009mg/mL，組分4為20.524mg/mL，組分5為40.435mg/mL，組分6為非蛋白組分。

2.2 抗氧化活性分析

2.2.1 還原力的測(cè)定結(jié)果

圖2 中華鱉提取物各組分還原力比較Fig.2 Concentration dependence of reducing power of various protein fractions from Chinese soft-shelled turtle

由圖2可知，隨著各組分樣品質(zhì)量濃度的增大各組分的還原能力也依次增強(qiáng)，但各組分的還原力存在一定差異。6個(gè)組分還原力的大小順序依次為1＞2＞3＞5＞4＞6。經(jīng)直線回歸分析，回歸方程分別為：y1=0.3374x+0.0413(R2=0.9962)；y2=0.2536x+0.0185(R2=0.9907)；y3=0.2561x－ 0.0655(R2=0.9789)；y4=0.1361x+0.0805(R2=0.9345)；y5=0.1395x－ 0.07(R2=0.9925)；y6=0.0441x－ 0.002(R2=0.9449)。

2.2.2 DPPH自由基清除率的測(cè)定結(jié)果

圖3 中華鱉提取液各組分清除DPPH自由基的量效關(guān)系Fig.3 Concentration dependence of DPPH free radial scavenging capacity of various protein fractions from Chinese soft-shelled turtle

由圖3可知，各組分對(duì) DPPH自由基均有不同程度的清除作用，且清除率隨樣品質(zhì)量濃度的增加而增強(qiáng)。經(jīng)直線回歸分析(回歸方程分別為：y1=11.303x+47.584(R2=0.9979)；y2=8.9186x+32.761(R2=0.9997)；y3=5.3231x+8.334(R2=0.9611)；y4=10.798x+6.1495(R2=0.9721)；y5=8.4111x+10.084(R2=0.9919)；y6=4.6474x－0.213(R2=0.9894)，其清除率均與其質(zhì)量濃度成明顯的直線關(guān)系。經(jīng)計(jì)算各組分的IC50值分別為：0.21、1.94、3.56、4.06、4.76、10.80mg/mL。IC50值越低，其對(duì)應(yīng)的參試樣品抗氧化活性越強(qiáng)。樣品的IC50值排序?yàn)?＜2＜3＜4＜5＜6。

2.3 分離蛋白的SDS-PAGE電泳

圖4 中華鱉各組分的SDS-PAGE電泳圖譜Fig.4 SDS-PAGE of various protein fractions from Chinese softshelled turtle

圖5 相對(duì)電泳遷移率與lgMW之間的關(guān)系Fig.5 Relationship between relative electrophoretic mobility and lgMW

由圖4、5可知，組分1主要為糖蛋白成分，沒有明顯的蛋白條帶。組分2為水溶性蛋白組分，分子鏈的分子質(zhì)量為200、39.4、32.2、28、25.9、23.4kD和15.3kD，并且在分子質(zhì)量100kD與40kD之間，有少量蛋白溶出，由于樣品處理過程中添加了巰基乙醇，因此推斷組分2的蛋白中可能含有二硫鍵，被巰基乙醇破壞后解離成分子質(zhì)量更小的幾條鏈。組分3為堿溶性蛋白，有分子質(zhì)量為38.6kD的一個(gè)條帶。組分4為酸溶性蛋白，有分子質(zhì)量為66.2kD的一個(gè)條帶。綜合以上數(shù)據(jù)，可以得到，各組分含有幾種不同分子質(zhì)量的蛋白，且差異較大，但是分子質(zhì)量基本在10～200kD。

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)抗氧化能力的測(cè)定發(fā)現(xiàn)，糖蛋白及水溶性蛋白具有較強(qiáng)的還原力及DPPH自由基清除活性，同時(shí)得出其抗氧化性和質(zhì)量濃度呈明顯的線性相關(guān)，在一定范圍內(nèi)，質(zhì)量濃度越高，抗氧化性越強(qiáng)，說明其具有良好的抗氧化活性，由此，可將其添加至功能性抗氧化食品中，不僅增加食品營(yíng)養(yǎng)，更具有多種保健功能，另外，同樣可用于食品保藏等其他領(lǐng)域。中華鱉抗氧化作用顯著，同時(shí)也是使用者良好的蛋白來源，其在食品、醫(yī)藥等工業(yè)中有廣闊的應(yīng)用前景，但關(guān)于中華鱉活性組分多肽的進(jìn)一步分離、純化、鑒定還有待于進(jìn)一步研究。

[1] 劉彥, 劉承初. 甲魚的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值與保健功效研究進(jìn)展[J]. 上海農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2010, 26(2):93-96.

[2] 汪祿祥, 劉家富. 藥用龜板的氨基酸和礦質(zhì)元素分析[J]. 云南農(nóng)業(yè)科技, 2006(1):36-37.

[3] 江蘇新醫(yī)學(xué)院. 中藥大辭典(下冊(cè))[M]. 上海:上海科學(xué)技術(shù)出版社,1986:2722-2727.

[4] HOHLFELD J, ROESSINGH A B, HIRT-BURRI N, et al. Tissue engineered fetal skin constructs for paediatric burns[J]. The Lancet,2005, 366(9488):840-842.

[5] GB/T 5009. 5—2003食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定[S].

[6] YEN G C, DUH P D. Antioxidative properties ofmethanolic extacts from peanut hulls[J]. Journal of American Oil Chemists Society, 1993, 70:383-386.

[7] VINEET K, ANITA R, AMIT K D, et al. A comparative assessment of total phenolic content, ferric reducing-anti-oxidative power, free radicalscavenging activity, vitamin C and isoflavones content in soybean with varying seed coat colour[J]. Food Research International, 2010, 43(1):323-328.

[8] 馮翠萍, 王曉聞, 程旭東, 等. 靈芝孢子粉多糖的提取及其生物活性研究[J]. 中國(guó)食品學(xué)報(bào), 2009, 9(3):58-62.

[9] PINTHUS E J, SAGUY I S. Initial interfacial tension and oil up take by deep- fat fried foods[J]. Food Sci, 1994, 59:804-807.

[10] 崔鳳杰, 閆桂強(qiáng), 黃達(dá)明, 等. 酶法降解小麥面筋蛋白制備抗氧化產(chǎn)物的研究[J]. 食品研究與開發(fā), 2007(11):81-84.

[11] DAWIDOWICZ A L, WIANOWSKA D, BARANIAK B. The antioxidant properties of alcoholic extracts fromSambucus nigraL. (antioxidant properties of extracts)[J]. LWT - Food Science and Technology, 2006,39(3):308-315.

[12] 汪家政, 范明. 蛋白質(zhì)技術(shù)手冊(cè)[M]. 北京:科學(xué)出版社, 2000:77-108.

[13] 張龍翔, 張庭芳, 李令媛. 生化實(shí)驗(yàn)方法和技術(shù) [M]. 北京:高等教育出版社,1981:112-118.

Sequential Extraction of Protein Fractions from Chinese Soft-shelled Turtle (Pelodiscus sinensis) and Their Antioxidant Activities

LIU Yan1，LIU Cheng-chu1,*，YANG Jing-ya1，LIU Qi-gen2，LI Ying-sen2，LI Jia-le2,3
(1. College of Food Science and Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China；2. Key Laboratory of Exploration and Utilization of Aquatic Genetic Resources, Ministry of Education, Shanghai Ocean University,Shanghai 201306, China；3. Aquaculture Division, E-Institute of Shanghai Universities, Shanghai 201306, China)

TQ93

A

1002-6630(2010)21-0081-04

2010-06-28

上海海洋大學(xué)駱肇蕘大學(xué)生科技創(chuàng)新基金項(xiàng)目(A-2900-08-001519)；農(nóng)業(yè)部公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)(200903028)；上海高校創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)項(xiàng)目；上海市教育委員會(huì)重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目(J50704)

劉彥(1985—)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)楹Ｑ筚Y源開發(fā)與利用。E-mail：79030199@163.com

*通信作者：劉承初(1965—)，女，教授，博士，研究方向?yàn)楹Ｑ笊镔Y源利用、營(yíng)養(yǎng)與食品安全。E-mail：ccliu@shou.edu.cn