酶解花生蛋白制備功能性短肽條件優(yōu)化研究

范遠(yuǎn)景，孟凡莉，易苗苗，高海成，陳 偉，張華傳，陳蘇霞

(1.合肥工業(yè)大學(xué)生物與食品工程學(xué)院，安徽 合肥 230009；2.安徽凱利糧油食品有限公司，安徽 合肥 231600)

酶解花生蛋白制備功能性短肽條件優(yōu)化研究

范遠(yuǎn)景1，孟凡莉1，易苗苗1，高海成1，陳 偉2，張華傳2，陳蘇霞2

(1.合肥工業(yè)大學(xué)生物與食品工程學(xué)院，安徽 合肥 230009；2.安徽凱利糧油食品有限公司，安徽 合肥 231600)

為優(yōu)化Alcalase蛋白酶酶解花生蛋白制備功能性多肽的工藝條件，采用響應(yīng)面分析法，以水解度、短肽得率為響應(yīng)值，研究溫度、pH值、底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)、酶底比對(duì)制備功能性多肽工藝的影響。綜合考慮成本和工藝要求等問(wèn)題，最終確定酶解花生蛋白制備功能性多肽的工藝條件為溫度55℃、pH8.4、底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)4.31%、酶底比3.39%、時(shí)間4h。該條件下水解度(DH)及三氯乙酸可溶性氮溶解指數(shù)(TCA-NSI)分別為23.40%和74.88%，與理論值的相對(duì)誤差在0.5%以內(nèi)，優(yōu)化工藝穩(wěn)定，DH及TSA-NSI較高，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與模型預(yù)測(cè)值相符。

花生蛋白；功能性多肽；酶解；響應(yīng)面分析法

Abstract：In the present study, alkaline protease hydrolysis was used for the preparation of functional polypeptides from peanut protein. In order to optimize the enzymatic hydrolysis of peanut protein, the effects of temperature, pH, substrate concentration, enzyme amount on degree of hydrolysis (DH) and trichloroacetic acid nitrogen solubility index (TCA-NSI) were explored using response surface methodology. The optimal conditions for achieving both high DH and TCA-NSI were found to be hydrolysis temperature of 55 ℃, pH 8.4, substrate concentration of 4.31%, protease amount of 3.39% and hydrolysis time of 4 h. Under these optimal conditions, a DH of 23.40 and a TCA-NSI of 74.88% were obtained. The experimental values were consistent with the predicted ones with a relative error within 0.5%, indicating that these optimized hydrolysis conditions are reliable.

Key words：peanut protein；functional polypeptide；enzymatic hydrolysis；response surface methodology

花生蛋白中氨基酸分布廣泛，含有人體必需的8種氮基酸，屬于完全蛋白。在人體必需的8種氨基酸中，除蛋氨酸含量較低外，賴氨酸、色氨酸、蘇氨酸含量均接近聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織所規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)，而其他4種氨基酸含量也接近或超過(guò)了此標(biāo)準(zhǔn)，其構(gòu)成比例適中，而且賴氨酸含量比大米、小麥、玉米粉高3～8倍，其有效利用率達(dá)98.94%，而大豆中的賴氨酸有效利用率僅為78%。花生中富含精氨酸、谷氨酸和天門冬氨酸，精氨酸具有調(diào)節(jié)血糖、有效保護(hù)肝臟、增強(qiáng)人體免疫力和抗疲勞等功效，后兩種氨基酸則對(duì)腦細(xì)胞發(fā)育和增強(qiáng)記憶力有良好的促進(jìn)作用[1-3]。

生物活性短肽具有免疫調(diào)節(jié)、激素調(diào)節(jié)、降血壓、降血脂、抗疲勞、抗氧化等生理調(diào)節(jié)功能，是當(dāng)前國(guó)際醫(yī)藥界、食品界最熱門的研究課題和極具發(fā)展前景的功能因子[4-7]。雖然國(guó)內(nèi)外對(duì)植物蛋白活性肽的研究達(dá)到了一定水平，相關(guān)產(chǎn)品已應(yīng)用于醫(yī)療保健，但主要為大豆活性肽產(chǎn)品，而對(duì)花生短肽的研究才剛剛起步，相關(guān)產(chǎn)品開(kāi)發(fā)甚少，無(wú)法滿足食品需求[8-10]。在我國(guó)花生長(zhǎng)期以來(lái)大都用作榨油和飼料，存在很大的資源浪費(fèi)[11-12]。因此開(kāi)發(fā)花生活性肽可以改善這類局面。

本實(shí)驗(yàn)針對(duì)短肽類產(chǎn)品低水解度、低得率的問(wèn)題，進(jìn)行深入研究，以冷榨花生蛋白粉為原料，利用酶法水解工藝制備花生短肽，通過(guò)考察溫度、pH值、底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)、酶底比對(duì)堿性蛋白酶酶解花生蛋白的影響，利用二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)方法確定最佳酶解工藝條件，從而制備出高得率和高水解度的功能短肽。為花生功能性短肽產(chǎn)業(yè)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

花生蛋白粉(自制)；堿性蛋白酶(食品級(jí)) 南寧龐博生物工程有限公司；三氯乙酸(分析純) 廣東汕頭市西隴化工廠；牛血清蛋白(分析純) Solarbio公司。

1.2 儀器與設(shè)備

KA-1000離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；R-210旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海申勝生物技術(shù)有限公司；752紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海光譜儀器有限公司；LGL-12冷凍干燥機(jī) 北京松源華興科技發(fā)展有限公司；精密pH計(jì) 上海虹益儀表有限公司。

1.3 方法

1.3.1 制備花生短肽的工藝路線

花生分離蛋白(過(guò)100目篩)→用蒸餾水配制成8g/100mL→堿溶酸沉→酶解→離心→水解液→滅酶→水解蛋白液→分離→水解蛋白短肽

堿溶酸沉條件：pH8.50、溫度60℃、提取時(shí)間2h；酶解條件：在55℃、pH8.0、加入3%(酶與花生蛋白的質(zhì)量比)堿性蛋白酶，酶解5h；離心條件：4000r/min、離心10min；滅酶條件：90℃加熱15min。

1.3.2 測(cè)定方法

1.3.2.1 水解度的測(cè)定

水解度(DH)采用pH-stat法[13-14]測(cè)定。

式中：DH為水解度/%；VNaOH為堿液體積/mL；CNaOH為堿液的濃度/(mol/L)；α為氨基的解離度，α=[10(pH-pK)]/[1+10(pH-pK)]，其中pK值為a-氨基酸的平均pK值，取7.0；pH為反應(yīng)起始的pH值；mp為底物中蛋白質(zhì)總質(zhì)量/g；htot為底物中蛋白質(zhì)中肽鍵總數(shù)/(mmol/g)，對(duì)花生蛋白而言，htot=7.13(根據(jù)花生蛋白的氨基酸組成計(jì)算得到)。

1.3.2.2 短肽得率測(cè)定

短肽得率采用三氯乙酸-可溶性氮法(TCA-NSI)[15]測(cè)定?？扇苄缘芙庵笖?shù)(TCA-NSI)按式(2)計(jì)算。

TCA-NSI=TCA上清液總氮量/蛋白溶液總氮量×100% (2)

1.3.3 響應(yīng)曲面(response surface methodology，RSM)分析

中心組合設(shè)計(jì)(central composite-orthogonal design，CCD)是研究多因素問(wèn)題強(qiáng)有力的工具，在食品工業(yè)中應(yīng)用最為廣泛[16]。本實(shí)驗(yàn)在完整的單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，采用SAS8.1設(shè)計(jì)了四因素五水平的CCD。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶解條件的單因素試驗(yàn)

因各種蛋白酶的底物特異性及作用位點(diǎn)的差異，不同蛋白酶作用于花生蛋白而得到的酶解產(chǎn)物的功能也有所不同。因此在本課題的前期研究工作中[17]，在采用堿性蛋白酶、風(fēng)味酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶各自的最適溫度、pH值及底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)([S])、酶底比([E]/[S])、反應(yīng)時(shí)間的條件下酶解花生分離蛋白4h，并根據(jù)5種不同蛋白酶的水解度(DH)和三氯乙酸可溶性氮溶解指數(shù)(TCA-NSI)篩選出最合適的酶種為堿性蛋白酶(Alcalase)。

在酶種確定的前提下，影響蛋白質(zhì)水解物的DH和TCA-NSI的主要因素有底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)、酶底比、反應(yīng)溫度、pH值及時(shí)間等[7]，因而單因素試驗(yàn)分別討論了上述因素對(duì)酶解效果的影響。

2.1.1 不同溫度對(duì)DH和TCA-NSI的影響

堿性蛋白酶在50～65℃范圍內(nèi)水解花生蛋白時(shí)的DH和TCA-NSI的變化如圖1所示。

圖1 溫度對(duì)DH和TCA-NSI的影響Fig.1 Effect of hydrolysis temperature on DH and TCA-NSI

圖1結(jié)果顯示：在50～60℃過(guò)程中體系的DH和TCA-NSI逐漸上升，在60℃左右時(shí)DH和TCA-NSI最大，60℃以后體系的DH和TCA-NSI逐漸下降。因此堿性蛋白酶水解花生蛋白的最適溫度在55～60℃。

2.1.2 不同pH值對(duì)水解DH和TCA-NSI的影響

堿性蛋白酶在pH6.0、7.0、8.0、9.0、10.0條件下水解花生蛋白時(shí)的DH和TCA-NSI的變化如圖2所示。

圖2 pH值對(duì)DH和TCA-NSI的影響Fig.2 Effect of pH on DH and TCA-NSI

由圖2可知，pH值小于7.0時(shí)體系的DH及TCANSI都很小，說(shuō)明堿性蛋白酶更適合于堿性環(huán)境。隨著pH值增大，體系的DH及TCA-NSI都逐漸上升，到pH9.0時(shí)，二者都達(dá)到最大值，pH9.0以后體系的DH及TCANSI都有下降的趨勢(shì)?？梢?jiàn)堿性蛋白酶的最適pH值在8.0～9.0之間?？紤]到pH值從8.0上升到9.0短肽得率并沒(méi)有多大提高，而且在實(shí)際生產(chǎn)中pH值的升高會(huì)增加脫鹽的成本，因此確定pH值為8.0。

2.1.3 底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)DH和TCA-NSI的影響

堿性蛋白酶在底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%～12%范圍內(nèi)水解花生蛋白時(shí)的DH和TCA-NSI的變化如圖3所示。

圖3 底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)DH和TCA-NSI的影響Fig.3 Effect of substrate concentration on DH and TCA-NSI

由圖3可知，底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)DH和TCA-NSI的影響不完全一致。底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)在4%～12%范圍內(nèi)，體系的DH是呈下降趨勢(shì)，存在明顯的底物抑制現(xiàn)象。當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量分?jǐn)?shù)從4%增加到8%時(shí)，DH下降幅度較大，而后幅度逐漸變小。另一方面，底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)TCANSI的影響曲線呈鐘形，底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%～8%之間，TCA-NSI隨著底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)增大而增大，8%時(shí)達(dá)到最大，之后隨著底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)增大而逐漸變小。綜合DH和TCA-NSI兩個(gè)指標(biāo)考慮，堿性蛋白酶水解花生蛋白的最適底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)在6%左右。

2.1.4 酶底比對(duì)DH和TCA-NSI的影響

堿性蛋白酶在酶底比0.5%～8%范圍內(nèi)水解花生蛋白時(shí)的DH和TCA-NSI的變化如圖4所示。

圖4 酶底比對(duì)DH和TCA-NSI的影響Fig.4 Effect of enzyme-to-substrate ratio on DH and TCA-NSI

如圖4可以看出，酶底比在0.5%～8%范圍內(nèi)，DH和TCA-NSI的變化呈現(xiàn)相似的趨勢(shì)，在酶底比0.5%～3%之間，DH和TCA-NSI隨著酶底比的增加而快速增加，酶底比4%以后DH和TCA-NSI的增幅并不明顯。因此當(dāng)酶底比達(dá)到4%時(shí)，再進(jìn)一步增加酶底比對(duì)提高肽的得率已沒(méi)有明顯效果，此時(shí)蛋白酶對(duì)底物的作用位點(diǎn)已大大減少，因而水解度隨著酶底比的加大基本不再變化。由此確定堿性蛋白酶最適酶底比在3%～4%之間。

2.1.5 反應(yīng)時(shí)間對(duì)DH和TCA-NSI的影響

堿性蛋白酶水解花生蛋白0～5h內(nèi)DH和TCA-NSI的變化如圖5所示。

圖5 反應(yīng)時(shí)間對(duì)DH和TCA-NSI的影響Fig.5 Effect of hydrolysis time on DH and TCA-NSI

由圖5可知，堿性蛋白酶水解花生蛋白分為兩個(gè)階段，前120min水解反應(yīng)比較迅速，DH和TCA-NSI呈快速上升趨勢(shì)，水解120min時(shí)DH和TCA-NSI分別達(dá)到17.80%和54.94%。240min之后水解反應(yīng)速度減緩，DH和TCA-NSI的上升幅度減小。因此，確定堿性蛋白酶最適水解時(shí)間在240min左右。

2.2 二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合試驗(yàn)

采用二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合試驗(yàn)，在堿性蛋白酶單因素試驗(yàn)確定酶解4h的基礎(chǔ)上進(jìn)行組合設(shè)計(jì)。以水解溫度、pH值、底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)和酶底比4個(gè)因素共同作用，以DH和TCA-NSI為響應(yīng)值，按照表1的試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行四因素五水平共31次試驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)面分析，運(yùn)用SAS8.1統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，建立DH和TCANSI與各因素關(guān)系的數(shù)學(xué)模型，并通過(guò)對(duì)模型的分析以獲得最佳的水解工藝條件。

表1 中心組合試驗(yàn)因素水平編碼表Table 1 Factors and levels in the central composite design

2.2.1 DH回歸方程的建立與檢驗(yàn)

根據(jù)表2結(jié)果計(jì)算各項(xiàng)回歸系數(shù)，建立DH(Y1)與4因素的數(shù)學(xué)回歸模型為：

表2 回歸設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果處理表Table 2 Central composite design arrangement and experimental results

由表3方差分析可知，回歸方程的失擬性檢驗(yàn)F1=3.959241＜F0.05(10,6)=4.06不顯著，可以認(rèn)為所選用的二次回歸模型是合適的。回歸方程的顯著性檢驗(yàn)F2=29.44＞F0.01(14,16)=3.45極顯著，說(shuō)明回歸模型的預(yù)測(cè)值與實(shí)際值非常吻合，模型成立。對(duì)回歸系數(shù)顯著性檢驗(yàn)，在α=0.10顯著水平剔除不顯著項(xiàng)，得到優(yōu)化后的方程為：

表3 回歸方程各項(xiàng)的方差分析表Table 3 Variance analysis for each term of the established regression equation with DH as a function

由均方分析可見(jiàn)，影響DH的4因素的主次順序是p H值、酶底比、溫度、底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

溫度和pH值的交互作用對(duì)DH影響的響應(yīng)面分析見(jiàn)圖6。

圖6 溫度和pH值交互作用對(duì)DH影響的響應(yīng)面和等高線分析Fig.6 Response surface and contour plots showing the interactive effects of temperature and pH on DH

由圖6可知，開(kāi)始時(shí)隨著溫度(X1)和pH值(X2)的升高，DH(Y1)逐漸增加；但當(dāng)溫度和pH值升高到一定程度時(shí)，DH開(kāi)始下降。即溫度和pH值過(guò)高或過(guò)低時(shí)，DH均不能達(dá)到最大值。

2.2.2 TCA-NSI回歸方程的建立與檢驗(yàn)

表4 回歸方程各項(xiàng)的方差分析表Table 4 Variance analysis for each term of the established regression equation with TCA-NSI as a function

由表4方差分析可知，回歸方程的失擬性檢F1=2.661336＜F0.05(10,6)=4.06不顯著，可以認(rèn)為所選用的二次回歸模型是合適的。回歸方程的顯著性檢驗(yàn)F2=31.176＞F0.01(14,16)=3.45極顯著，說(shuō)明回歸模型的預(yù)測(cè)值與實(shí)際值非常吻合，模型成立。對(duì)回歸系數(shù)顯著性檢驗(yàn)，在α=0.10顯著水平剔除不顯著項(xiàng)，得到優(yōu)化后的方程為：

由均方分析可見(jiàn)，影響TCA-NSI的4因素的主次順序是p H值、酶底比、溫度、底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

溫度和pH值的交互作用對(duì)TCA-NSI的響應(yīng)面分析見(jiàn)圖7。

由圖7可知，隨著溫度(X1)的升高，TCA-NSI(Y2)逐漸增加；在堿性條件下，酶解溫度的升高，也會(huì)加劇花生蛋白的變性，使TCA-NSI向著增大的趨勢(shì)發(fā)展。隨著pH值(X2)的增大，TCA-NSI先增大后減小。

pH值和底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的交互作用對(duì)TCA-NSI的響應(yīng)面分析見(jiàn)圖8。

圖7 溫度和pH值交互作用對(duì)TCA-NSI影響的響應(yīng)面和等高線分析Fig.7 Response surface and contour plots showing the interactive effects of temperature and pH on TCA-NSI

圖8 pH值和底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)CA-NSI影響的響應(yīng)面和等高線分析Fig.8 Response surface and contour plots showing the interactive effects of pH and substrate concentration on TCA-NSI

由圖8可知，隨著pH值(X2)的增加，TCA-NSI(Y2)先增加后減??；隨著底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)(X3)的增加，TCANSI(Y2)先增加后減小，pH值和底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)之間存在交互作用。

2.3 酶解工藝參數(shù)的優(yōu)化組合及結(jié)果驗(yàn)證

通過(guò)SAS 8.1響應(yīng)面分析模擬得出DH最高得率23.40%的優(yōu)化組合X1=－0.17199、X2=－0.65463、X3=0.04476、X4=0.99302，即溫度為54.14℃、pH8.3、底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6.09%、酶底比為3.99%；通過(guò)SAS 8.1響應(yīng)面分析模擬得出TCA-NSI最高為74.88%的優(yōu)化組合為X1=0.02822、X2=－0.63356、X3=－0.84484、X4=0.39098，即溫度為55.14℃、pH8.4、底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4.31%、酶底比為3.39%；考慮底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)DH影響不顯著，對(duì)TCA-NSI影響極顯著，綜合各因素的影響大小，確定酶解最佳工藝參數(shù)為溫度55℃、pH8.4、底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4.31%、酶底3.39%、時(shí)間4h。根據(jù)最優(yōu)化組合的預(yù)測(cè)值進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果DH=(23.40±0.5)%、TCA-NSI=(74.88±0.5)%(n=3)。預(yù)測(cè)值與實(shí)際值基本一致，說(shuō)明預(yù)測(cè)條件與實(shí)際情況較符合。而通過(guò)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)所得優(yōu)化參數(shù)：pH8.0，反應(yīng)溫度為60℃、底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%、酶底比4%、水解時(shí)間240min。在此條件下DH和TCA-NSI分別為22.39%和58.15%。這與中心組合設(shè)計(jì)所得結(jié)果相差甚遠(yuǎn)，由此可得中心組合對(duì)因素和水平的組合具有廣泛應(yīng)用。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)利用堿性蛋白酶酶解花生蛋白制備多肽，通過(guò)完整的單因素試驗(yàn)和響應(yīng)曲面分析得到以下結(jié)論：

3.1 以水解度(DH)為響應(yīng)值，其回歸模型為：

3.2 以TCA-NSI為響應(yīng)值，其回歸模型為：

3.3 通過(guò)二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)確定制備花生功能性多肽的最佳酶解條件為溫度55℃、pH8.4、底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)4.31%、酶底比3.39%、時(shí)間4h。該條件下水解度(DH)及三氯乙酸可溶性氮溶解指數(shù)(TCA-NSI)分別為23.40%和74.88%。

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Optimization of Enzymatic Hydrolysis Conditions for Preparing Functional Polypeptide from Peanut Protein

FAN Yuan-jing1，MENG Fan-li1，YI Miao-miao1，GAO Hai-cheng1，CHEN Wei2，ZHANG Hua-chuan2，CHEN Su-xia2
(1. School of Biotechnology and Food Engineeing, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China；2. Anhui Kaili Cereals, Oils and Foodstuffs Co. Ltd., Hefei 231600, China)

TQ464.7

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1002-6630(2010)18-0031-06

2009-11-25

安徽省2008科技攻關(guān)計(jì)劃重大科技專項(xiàng)(08010302091)；合肥市科技項(xiàng)目(2008-1025)

范遠(yuǎn)景(1958—)，男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)。E-mail：swf89105@mail.hf.ah.cn