海帶中葉綠素的提取及間接測定方法研究

劉 輝，賀菊萍，秦 杰，唐仕榮，祝銀銀

(徐州工程學(xué)院食品(生物)工程學(xué)院，江蘇 徐州 221008)

海帶中葉綠素的提取及間接測定方法研究

劉 輝，賀菊萍，秦 杰，唐仕榮，祝銀銀

(徐州工程學(xué)院食品(生物)工程學(xué)院，江蘇 徐州 221008)

采用超聲波提取法對海帶中葉綠素進(jìn)行提取，原子吸收光譜法對提取出的葉綠素中的鎂離子進(jìn)行測定，從而間接得出海帶中葉綠素的含量。結(jié)果表明，超聲波提取葉綠素的最佳工藝條件：以無水乙醇與丙酮體積比1:1的混合液為提取劑，按料液比2:15(g/mL)，在室溫下超聲波選擇200W的功率提取2次，每次20min。反萃取的最佳測定工藝條件：用濃度為0.9mol/L的鹽酸15mL進(jìn)行反萃取15min。原子吸收法測定檢出限為0.008μg/mL，海帶中葉綠素的含量5.486mg/g，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差0.675%，回收率97.7%。此方法表明：原子吸收光譜法受干擾程度小，且精密度、靈敏度和準(zhǔn)確度較高。

海帶；葉綠素；超聲波提取；原子吸收光譜法

Abstract：Five technological conditions for the ultrasonic-assisted extraction of chlorophyll from kelp were investigated, and the back extraction of the extract with chlorohydric acid for the displacement of magnesium ions by hydrogen ions was optimized using single factor and orthogonal array design methods. Displaced magnesium ions were assayed by atomic absorption spectrometric (AAS) method. Therefore, the content of chlorophyll in kelp could be calculated from obtained magnesium concentration data. Based on these studies, an indirect method for quantifying chlorophyll in kelp has been set up. The optimal conditions for extracting chlorophyll based on the use of an absolute ethanol/acetone mixture as the extraction solvent were found to be:solid/liquid ratio (g/mL) 2:15 and ultrasonic power 200 W for twice extraction for 20 min each time. Chlorohydric acid concentration of 0.9 mol/L, chlorohydric acid amount of 15 mL and back extraction duration of 15 min were found optimal for the displacement of magnesium ions. The limit of detection of AAS method was 0.008 μg/mL. The average content of chlorophyll in kelp (n=5) was 5.486 mg/g, with a relative standard deviation of 0.675% and the average spike recovery for chlorophyll was 97.7%. The developed method for chlorophyll determination has the advantages of little disturbance and high precision, sensitivity and accuracy.

Key words：kelp；chlorophyll；ultrasonic-assisted extraction；atomic absorption spectrometric method

海帶是一種營養(yǎng)價(jià)值很高的蔬菜，由于海水可被利用的光能要比陸地上少得多，要完成能量的轉(zhuǎn)換，必須增高參與光合作用的葉綠素的含量。所以，一般來說，海帶中葉綠素和其他輔助色素的含量高于陸生植物。葉綠素依其結(jié)構(gòu)不同可分為葉綠素a和葉綠素b，其基本結(jié)構(gòu)都是鎂結(jié)合的卟啉環(huán)[1-2]。當(dāng)前測定葉綠素的常規(guī)方法多為溶劑浸提-可見分光光度法[3-7]，不足之處在于有機(jī)溶劑污染且其他有色物質(zhì)嚴(yán)重干擾光度法的測定。由于與卟啉配位的鎂可被氫置換形成脫鎂葉綠素，本實(shí)驗(yàn)用超聲波萃取分離出葉綠素[8-11]，然后用氫離子置換出鎂離子，再用原子吸收分光光度法測鎂的量即可計(jì)算出海帶中葉綠素的含量[12-15]，旨在為海帶的綜合利用提供參考，同時(shí)也可擴(kuò)大原子吸收法在分析測試中的應(yīng)用領(lǐng)域。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

海帶絲 市購；無水乙醇、丙酮、氯化鈉、鹽酸、石油醚(均為分析純)；0.1mg/mL鎂標(biāo)準(zhǔn)液(國家二級標(biāo)準(zhǔn)液)。

1.2 儀器與設(shè)備

KBS-250型數(shù)控超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 昆山市超聲儀器有限公司；732C可見分光光度計(jì) 上海欣茂儀器有限公司；TAS-990原子吸收分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.3 方法

稱取4g粉碎后的海帶于燒杯中，加入30mL有機(jī)提取劑，用保鮮膜封口，室溫200W超聲波提取20min，過濾，收集濾液。

移取8mL濾液于分液漏斗中，加入4mL的石油醚和等量飽和氯化鈉溶液萃取，加12mL的超純水洗滌有機(jī)相，重復(fù)萃取兩次，洗去提取溶劑及無機(jī)態(tài)鹽類，合并石油醚相。于石油醚相中加入0.9mol/L鹽酸15mL反萃取15min，分取水相，用超純水定容于50mL容量瓶中，用原子吸收分光光度計(jì)測定此溶液中鎂的質(zhì)量濃度。測定條件為空氣-乙炔火焰，鎂波長285.2nm，狹縫寬度0.2nm，燈電流3mA，燃燒器高度5.0mm。

原子吸收法測定海帶中葉綠素含量的計(jì)算，見式(1)。

式中：C為由標(biāo)準(zhǔn)曲線得被測試液中鎂的質(zhì)量濃度/(μg/mL)；m為稱樣量/g；V1為混合提取液的總體積/mL；V2為移取石油醚相的體積/mL；V3為返萃水相的定容體積/mL；899.3為葉綠素a、葉綠素b的平均摩爾質(zhì)量/(g/mol)；24為鎂的摩爾質(zhì)量/(g/mol)。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲波提取法條件的選擇

2.1.1 提取劑的選擇

圖1 不同提取劑對吸光度的影響Fig.1 Effect of extraction solvent type on chlorophyll yield

由圖1可知，不同的提取的其提取效果差異比較大，混合液的提取效果要比單一試劑好。混合液從海帶中直接提取葉綠素效率明顯提高，可以認(rèn)為是一種協(xié)萃現(xiàn)象。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇混合液A(無水乙醇:丙酮=1:1)為提取劑。

2.1.2 提取劑用量的選擇

圖2 提取劑用量對吸光度的影響Fig.2 Effect of extraction solvent amount on chlorophyll yield

由圖2可知，不同的提取劑用量對提取效果影響明顯。提取過程中當(dāng)包容固體的溶液的溶質(zhì)濃度和浸出液溶質(zhì)濃度相等時(shí)，提取達(dá)到平衡。提取劑用量較少時(shí)，葉綠素浸出液的吸光度較小，當(dāng)提取液用量增至30mL時(shí)，吸光度繼續(xù)增大，但是幅度不大，綜合考慮溶劑消耗和回收溶劑的成本，選擇料液比2:15(g/mL)較為適宜。

2.1.3 提取時(shí)間的選擇

圖3 提取時(shí)間對吸光度的影響Fig.3 Effect of extraction duration on chlorophyll yield

由圖3可見，提取初期，隨著提取時(shí)間的延長，吸光度不斷增加，當(dāng)提取時(shí)間為20min時(shí)，吸光度最大，后來吸光度基本保持不變，考慮到節(jié)省時(shí)間，所以選擇提取時(shí)間20min。

2.1.4 提取功率的選擇

圖4 提取功率對吸光度的影響Fig.4 Effect of ultrasonic power on chlorophyll yield

由圖4可見，起初吸光度隨著超聲波功率的上升而增加，當(dāng)功率達(dá)到200W時(shí)，吸光度達(dá)到最大值。超聲波功率繼續(xù)上升時(shí)，吸光度反而下降，其原因可能功率太高，對葉綠素分子會(huì)有一定的破壞作用，致使色素提取效率降低。所以選擇提取功率200W。

2.1.5 提取次數(shù)的選擇

圖5 提取次數(shù)對吸光度的影響Fig.5 Effect of extraction number on chlorophyll yield

由圖5可知，第1次提取已經(jīng)把絕大部分的葉綠素提取出來，第2次提取量僅僅是第1次的18%，第3次為第1次的6.8%，第4次僅為第1次的1.4%。因此，超聲波提取海帶中的葉綠素，沒有必要進(jìn)行多次提取，二級提取已經(jīng)足夠。

2.1.6 超聲波提取條件的確立

超聲波提取海帶中葉綠素的最佳工藝條件：使用無水乙醇與丙酮配比為1:1(體積比)的混合液為提取劑，料液比為2:15(g/mL)，在室溫條件下超聲波功率200W提取2次，每次20min。

2.2 反萃取條件選擇

2.2.1 反萃取鹽酸濃度的選擇

圖6 反萃取鹽酸濃度對吸光度的影響Fig.6 Effect of chlorohydric acid concentration on the displacement of magnesium ions

由圖6可看出，隨著鹽酸濃度的增加，反萃取出的鎂離子量先逐漸增加后基本保持不變。當(dāng)鹽酸濃度為0.9mol/L時(shí)，反萃取效果最好，反萃取較完全，且鹽酸的濃度不是很大，不會(huì)對原子吸收分光光度計(jì)有損壞。因此，實(shí)驗(yàn)選擇0.9mol/L的鹽酸作為反萃取試劑。

2.2.2 反萃取鹽酸用量的選擇

圖7 反萃取鹽酸用量對吸光度的影響Fig.7 Effect of chlorohydric acid amount on the displacement of magnesium ions

由圖7可看出，當(dāng)鹽酸用量為15mL時(shí)，反萃取效果最好，隨著鹽酸用量的繼續(xù)增加，吸光度基本保持不變，從實(shí)際成本的角度考慮，使用反萃取鹽酸的用量為15mL。

2.2.3 反萃取時(shí)間的選擇

圖8 反萃取時(shí)間對吸光度的影響Fig.8 Effect of back extraction duration on the displacement of magnesium ions

由圖8可看出，當(dāng)用0.9mol/L鹽酸15mL反萃取15min時(shí)吸光度達(dá)到最大，繼續(xù)延長反萃取時(shí)間，吸光度增加不是很明顯。所以考慮到節(jié)約時(shí)間，反萃取15min效果最好。

2.2.4 正交試驗(yàn)優(yōu)化

考慮到葉綠素反萃取過程中鹽酸濃度、反萃取時(shí)間、鹽酸用量因素的相互影響，建立三因素三水平正交表，因素水平設(shè)定及結(jié)果見表1、2。

表1 反萃取正交試驗(yàn)因素水平設(shè)定Table 1 Factors and levels in the orthogonal array design for optimizing back extraction conditions

由表2可以看出，試驗(yàn)中A2B2C3方案的吸光度最大，即葉綠素的含量最高。根據(jù)極差R值進(jìn)行分析，各因素的主次關(guān)系為A＞B＞C，而分析最佳為A2B2C2。

由于分析得到的最佳水平組合和實(shí)際得到的最優(yōu)水平組合不一致，因此將A2B2C3與A2B2C2做對比實(shí)驗(yàn)，結(jié)果A2B2C2的值較大，吸光度為0.756。故海帶中葉綠素反萃取的最佳提取條件為用0.9mol/L的鹽酸15mL反萃取15min。

表2 反萃取正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Arrangement and experimental results of the orthogonal array design for optimizing back extraction conditions

2.3 鎂標(biāo)準(zhǔn)曲線

在實(shí)驗(yàn)條件下，鎂的含量在0.1～4.0μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。回歸方程為A=0.2404c+0.0029，線性相關(guān)系數(shù)為0.9992，檢出限為0.008μg/mL。

2.4 干擾離子實(shí)驗(yàn)

向樣品的超聲波提取液中分別加入1mL的50μg/mL的Ca2+、SO42-、PO43-離子，按實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行分析測定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3 離子干擾的檢測Table 3 Disturbing effect of other ions on the determination of magnesium ions

由表3可見，大量的Ca2+、SO42-、PO43-離子對測定結(jié)果幾乎沒有影響，可能是在水洗過程中這些無機(jī)離子被水洗去，且原子吸收光譜法測量的是離子主要針對鎂離子，其他離子的干擾影響幾乎很小，可以忽略不計(jì)。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)加入萃取回收實(shí)驗(yàn)

在選定的最佳條件下，對海帶中的鎂進(jìn)行加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表4。

由表4可以看出，原子吸收光譜法測得海帶中葉綠素的含量為5.486mg/g，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.675%，回收率約為97.7%，結(jié)果令人滿意。

表4 原子吸收法海帶中葉綠素含量Table 4 Contents of chlorophyll in kelp determined by AAS method

2.6 國標(biāo)法測定樣品中葉綠素含量

取1mL超聲波萃取后的提取液，于1L容量瓶中，加水稀釋，定容，搖勻后，按國標(biāo)方法[15]測得在649nm和665nm波長處的吸光度，再利用公式計(jì)算出葉綠素含量，結(jié)果見表5。

表5 國標(biāo)法測定海帶中葉綠素含量Table 5 Contents of chlorophyll in kelp determined by the national standard method

由表5可以看出，國標(biāo)法測得海帶中葉綠素的含量為4.949mg/g，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.090%，與上述的原子吸收光譜法相比較，很明顯不如原子吸收光譜法測量的精密度高。

3 結(jié) 論

3.1 采用超聲波提取法對海帶中葉綠素進(jìn)行提取。具有提取速度快、產(chǎn)率高、無需加熱、節(jié)約能源等優(yōu)點(diǎn)。

3.2 通過測定海帶中葉綠素的含量，探索了用原子吸收分光光度法間接測定綠色植物中葉綠素含量的方法。此法具有樣品處理簡單、測定準(zhǔn)確、靈敏度高、干擾少，具有特效性等優(yōu)點(diǎn)，明顯優(yōu)于國標(biāo)法。

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Extraction and Indirect Measurement of Chlorophyll in Kelp

LIU Hui，HE Ju-ping，QIN Jie，TANG Shi-rong，ZHU Yin-yin
(College of Food (Biological) Engineering, Xuzhou Institute of Technology, Xuzhou 221008, China)

TS254.58；TS254.7

A

1002-6630(2010)18-0178-04

2010-06-11

劉輝(1969—)，女，副教授，碩士，研究方向?yàn)榉治雠c檢測。E-mail：1hljfish@126.com