殼聚糖-海藻酸鈉葉綠素亞鐵微膠囊的制備及緩釋性能研究

孟慶廷，陳萬(wàn)東

(濟(jì)寧學(xué)院化學(xué)與化工系，山東 濟(jì)寧 273155)

殼聚糖-海藻酸鈉葉綠素亞鐵微膠囊的制備及緩釋性能研究

孟慶廷，陳萬(wàn)東

(濟(jì)寧學(xué)院化學(xué)與化工系，山東 濟(jì)寧 273155)

用殼聚糖-海藻酸鈉微囊技術(shù)制備一系列葉綠素亞鐵微膠囊，以包封率和載藥量作為制備工藝優(yōu)化指標(biāo)，通過(guò)正交試驗(yàn)得出最優(yōu)方案。考察微膠囊在模擬胃液和模擬腸液中的控制釋放效果。結(jié)果顯示，制備該微膠囊的最優(yōu)方案為海藻酸鈉15mg/mL、殼聚糖4mg/mL、氯化鈣20mg/mL、芯材與海藻酸鈉的質(zhì)量比1:4。所得膠囊在模擬胃液和模擬腸液中緩釋性能良好。

殼聚糖-海藻酸鈉葉綠素亞鐵微膠囊；載藥量；包封率；緩釋

葉綠素亞鐵是一種具有補(bǔ)鐵保健功能的天然綠色色素，除了能夠用于鐵強(qiáng)化劑，治療缺鐵性貧血外，還可用作一些慢性病的輔助治療。葉綠素亞鐵具有抗菌、抗病毒、抗過(guò)敏和促進(jìn)組織再生等作用，是一種良好的造血細(xì)胞復(fù)合劑，對(duì)各種原因引起的白細(xì)胞減少癥及各種貧血有治療作用[1]，其補(bǔ)鐵效果優(yōu)于葉綠素鐵[2]。但葉綠素亞鐵的穩(wěn)定性較差，尤其在光照、高溫等條件下[3-4]。微膠囊化可以減輕外界環(huán)境對(duì)敏感芯材的影響程度，增加易氧化、易揮發(fā)、光敏性和熱敏性物料的穩(wěn)定性等，從而提高其儲(chǔ)存性能，改善可操作性[5-6]。殼聚糖和海藻酸鈉的生物相容性和降解性好，無(wú)毒副作用，是良好的藥物緩釋劑[7]。應(yīng)用殼聚糖、海藻酸鈉為壁材制備微膠囊，所得產(chǎn)物的包封率高[8-9]，緩釋效果明顯[10]，并且可有效地增加芯材的可吸收性，降低芯材的副作用[11]。

本實(shí)驗(yàn)利用殼聚糖和海藻酸鈉作材料，對(duì)制備葉綠素亞鐵微膠囊的工藝以及微膠囊在模擬胃液和模擬腸液中的緩釋性進(jìn)行了研究，旨在為葉綠素亞鐵的研究與應(yīng)用提供一些有價(jià)值的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

殼聚糖(黏度35CPS，脫乙酰度92.8%)；海藻酸鈉(化學(xué)純)；葉綠素亞鐵(由大蒜葉自制，純度98.7%)；氯化鈣、氫氧化鈉、醋酸、濃鹽酸、氯化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉均為分析純；PBS(0.5mol/L，pH7.2)；胃蛋白酶(4000U/mg)、胰蛋白酶(2500U/mg) 上海東風(fēng)生化試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

723型可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器廠；DZF-6020型干燥箱 嘉興中新醫(yī)療儀器有限公司； PHSP1型精密pH計(jì) 上海大中分析儀器廠；SHZ-Q型水浴恒溫振蕩器 常州市偉嘉儀器制造有限公司；800型高速離心機(jī) 上海手術(shù)醫(yī)療器械廠。

1.3 方法

1.3.1 制備工藝

稱取適量CaCl2，以1.0%乙酸溶解并稀釋成20mg/mL的CaCl2溶液。取適量殼聚糖，以上述氯化鈣溶液溶解，用0.10mol/L NaOH調(diào)節(jié)溶液pH值為5.5[12]。配制一定質(zhì)量濃度的葉綠素亞鐵溶液，并以一定比例的海藻酸鈉溶于其中。取4mL葉綠素亞鐵的海藻酸鈉溶液，用帶8號(hào)針頭的5mL注射器緩慢滴至盛有20mL的殼聚糖氯化鈣溶液中，滴加高度20mm，滴完后靜置30min，過(guò)濾并用水洗滌3次，收集微球，真空干燥。

1.3.2 葉綠素亞鐵含量的測(cè)定

1.3.2.1 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

產(chǎn)品的吸收曲線：配制一定質(zhì)量濃度的葉綠素亞鐵鹽溶液，用分光光度計(jì)對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行掃描，在404nm和655nm波長(zhǎng)處有兩處吸收峰。測(cè)定采用最大吸收峰404nm。

繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：以PBS溶液先配制質(zhì)量濃度0.1000mg/mL標(biāo)準(zhǔn)母液，然后分別移取0、1、2、3、4、5mL分別放入25mL容量瓶中，用PBS液定容為0.00、4.00、8.00、12.00、16.00、20.00μg/mL標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。以PBS溶液為參比，用分光光度計(jì)以1cm比色皿于404nm處分別測(cè)定吸光度。以葉綠素亞鐵質(zhì)量濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪出吸光度-葉綠素亞鐵含量標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1)。

1.3.2.2 樣品葉綠素亞鐵總量測(cè)定

精確稱取葉綠素亞鐵微膠囊1.000g，溶于PBS緩沖溶液中，振蕩器上破碎12h，低溫高速離心以除去殼聚糖、海藻酸鈉和殘?jiān)?，取上層液，測(cè)定吸光度，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得葉綠素亞鐵的含量。

1.3.2.3 表面葉綠素亞鐵量測(cè)定

精確稱取0.5000g樣品，加入少量去離子水輕輕攪拌，洗去表面葉綠素亞鐵，離心分離，收集上層清液，重復(fù)該步驟2次，合并上清液，定容至50mL，過(guò)濾。測(cè)定方法同1.3.2.2節(jié)。

1.3.3 評(píng)估指數(shù)的選取

以包封率(encapsulated efficiency，EE)、載藥量(drug loading，DL)為指標(biāo)綜合評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)結(jié)果以優(yōu)化處方，評(píng)估指數(shù)(evaluating indicator，EI)為：

1.3.4 微膠囊的體外釋放實(shí)驗(yàn)

1.3.4.1 在模擬胃液環(huán)境中的釋放

在50mL模擬胃液[13](200g NaCl、3.2g 胃蛋白酶、7.0mL濃鹽酸、雙蒸水定容于1000mL。pH值約為1.2)中加入一定量已干燥的膠囊，溫度37℃，轉(zhuǎn)速60r/min，在指定時(shí)間取樣，檢測(cè)葉綠素亞鐵含量，計(jì)算模擬胃液中釋放率。

1.3.4.2 在模擬腸液環(huán)境中的釋放

在上述胃液模擬液中處理一定時(shí)間的微膠囊，分離后水洗，加入50mL腸液模擬液[13](稱取6.8g KH2PO4溶于約500mL水中，另稱取l0g胰蛋白酶加水溶解，定容至1000mL，NaOH調(diào)節(jié)pH7.6)，溫度37℃，60r/min，在指定時(shí)間取樣，檢測(cè)葉綠素亞鐵含量，計(jì)算模擬腸液中釋放率。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉綠素亞鐵鹽的標(biāo)準(zhǔn)曲線

測(cè)得葉綠素亞鐵含量(x)和吸光度(y)之間的關(guān)系如圖1所示，線性回歸方程為y=0.0816x－0.0004，R2=0.9997，線性較好，可用于葉綠素亞鐵的定量測(cè)定。

圖1 葉綠素亞鐵標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of sodium- iron(Ⅱ) chlorophyllin

2.2 海藻酸鈉質(zhì)量濃度對(duì)微膠囊的影響

保持氯化鈣的質(zhì)量濃度20mg/mL、殼聚糖質(zhì)量濃度4mg/mL、葉綠素亞鐵:海藻酸鈉為1:4(m/m)，采用不同質(zhì)量濃度的海藻酸鈉制備一系列微膠囊，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 海藻酸鈉質(zhì)量濃度對(duì)包封率和載藥量的影響Fig.2 Effect of sodium alginate concentration on entrapment efficiency and drug loading

由圖2可知，當(dāng)海藻酸鈉質(zhì)量濃度小于20mg/mL時(shí)，微膠囊的載藥量和包封率隨著海藻酸鈉質(zhì)量濃度的增大而增大，之后隨著海藻酸鈉質(zhì)量濃度的增大而減小。這可能是由于海藻酸鈉質(zhì)量濃度太低時(shí)，殼聚糖-海藻酸鈉聚電解質(zhì)膜過(guò)薄，不能形成微球，或形成的微球機(jī)械強(qiáng)度低，不能有效地對(duì)芯材進(jìn)行包埋；海藻酸鈉質(zhì)量濃度過(guò)高，體系黏度大，包埋效果也不好[14]。

2.3 殼聚糖質(zhì)量濃度對(duì)微膠囊的影響

保持海藻酸鈉質(zhì)量濃度為15mg/mL、氯化鈣質(zhì)量濃度為20mg/mL、芯材與海藻酸鈉質(zhì)量之比為1:4不變，采用不同質(zhì)量濃度的殼聚糖制備系列微膠囊，結(jié)果如圖3所示。

圖3 殼聚糖質(zhì)量濃度對(duì)包封率和載藥量的影響Fig.3 Effect of chitosan concentration on entrapment efficiency and drug loading

從圖3可以看出，隨著殼聚糖質(zhì)量濃度的增大，微膠囊的包封率和載藥量呈增加的趨勢(shì)，但當(dāng)殼聚糖質(zhì)量濃度超過(guò)4mg/mL時(shí)，包封率及載藥量反而有所下降。當(dāng)殼聚糖質(zhì)量濃度為4mg/mL時(shí)，微膠囊的包封率以及載藥量都達(dá)到最佳水平。

2.4 氯化鈣質(zhì)量濃度對(duì)微膠囊的影響

保持殼聚糖的質(zhì)量濃度4mg/mL、海藻酸鈉的質(zhì)量濃度15mg/mL、芯材:海藻酸鈉為1:4，采用不同質(zhì)量濃度氯化鈣制備一系列微膠囊，結(jié)果如圖4所示。

圖4 氯化鈣質(zhì)量濃度對(duì)包封率和載藥量的影響Fig.4 Effect of CaCl2 concentration on entrapment efficiency and drug loading

由圖4可知，隨著氯化鈣質(zhì)量濃度的增大包封率及載藥量均提高。但是，當(dāng)氯化鈣質(zhì)量濃度超過(guò)15mg/mL后，這兩個(gè)方面反而下降，這表明較高的氯化鈣質(zhì)量濃度則會(huì)降低包封率和載藥量。這與Sezer 等[15]的研究結(jié)果一致。

2.5 芯材與海藻酸鈉的比例對(duì)微膠囊的影響

圖5 芯材壁材質(zhì)量比對(duì)包封率和載藥量的影響Fig.5 Effect of core material/wall material ratio on entrapment efficiency and drug loading

保持其他條件不變，采用不同比例的葉綠素亞鐵與海藻酸鈉制備微膠囊，所得產(chǎn)物的結(jié)果如圖5所示。隨著海藻酸鈉與芯材質(zhì)量比的增大，載藥率逐漸減小，包封率逐漸增大。海藻酸鈉與芯材比增大，一方面增強(qiáng)了微球?qū)π静牡陌饽芰?，使包封率增大，另一方面增加了微球的質(zhì)量，故使載藥率下降。

2.6 正交試驗(yàn)確定最佳條件

為了確定葉綠素亞鐵微膠囊制備的最佳條件，選取海藻酸鈉質(zhì)量濃度、殼聚糖質(zhì)量濃度、氯化鈣質(zhì)量濃度、葉綠素亞鐵與海藻酸鈉質(zhì)量比作為主要的考察因素，以微膠囊評(píng)估指數(shù)為考察指標(biāo)進(jìn)行正交試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表1。

在4種因素中，對(duì)評(píng)估指數(shù)影響的程度大小為D＞A＞C＞B，綜合多種制備因素，選擇最佳微膠囊制備條件為A1B2C3D3，即海藻酸鈉質(zhì)量濃度15mg/mL、殼聚糖質(zhì)量濃度4mg/mL、氯化鈣質(zhì)量濃度20mg/mL、芯材與海藻酸鈉質(zhì)量之比為1:4。

表1 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Orthogonal array design arrangement and experimental results

2.7 微膠囊的體外釋放實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在最優(yōu)化條件下制備葉綠素亞鐵微膠囊，并在模擬胃液和模擬腸液環(huán)境中進(jìn)行體外釋放實(shí)驗(yàn)，在模擬腸液環(huán)境中的釋放情況是在模擬胃液環(huán)境中處理60min后進(jìn)行的。結(jié)果見(jiàn)圖6、7。

圖6 葉綠素亞鐵微膠囊在模擬胃液中的釋放情況Fig.6 Time course of sustained release of chitosan-sodium alginate sodium-sodium ferrous chlorophyllin microcapsules in mimic gastric environment

圖7 葉綠素亞鐵微膠囊在模擬腸液環(huán)境中的釋放情況Fig.7 Time course of sustained release of chitosan-sodium alginate sodiumsodium ferrous chlorophyllin microcapsules in mimic intestinal environment

由圖6、7可見(jiàn)，在模擬胃液環(huán)境中停留60min后，微膠囊中芯材的釋放率即達(dá)32%。說(shuō)明在酸性條件下，微膠囊表面的殼聚糖膜及殼聚糖與海藻酸鈉的復(fù)合膜易于遭到破壞，導(dǎo)致內(nèi)容物釋放。在酸性溶液中停留時(shí)間越長(zhǎng)，微膠囊的控釋能力越低。若在模擬胃液環(huán)境中處理60min后，在模擬腸液環(huán)境中120min累計(jì)釋放率可達(dá)60%。

3 結(jié) 論

殼聚糖性質(zhì)穩(wěn)定，具有良好的生物可降解性和相容性，毒性極小(LD50為16g/kg)。海藻酸鈉不僅是一種安全的食品添加劑，而且可作為仿生食品或療效食品的基材，它在腸道中能抑制有害金屬如鍶、鎘、鉛等在體內(nèi)的積累[16]。殼聚糖與海藻酸鈉載體制備條件溫和，不需要有機(jī)溶劑，適合于有生物活性的蛋白質(zhì)類藥物以及穩(wěn)定性較差的芯材。殼聚糖與海藻酸鈉微囊法應(yīng)用于葉綠素亞鐵的包封，其制備簡(jiǎn)單快速，包封率好。制備的微囊在模擬胃液和模擬腸液中緩釋性能良好。正交試驗(yàn)結(jié)果表明葉綠素亞鐵與海藻酸鈉的質(zhì)量比對(duì)微膠囊的影響最大，制備微膠囊的最佳條件為海藻酸鈉質(zhì)量濃度15mg/mL、殼聚糖質(zhì)量濃度4mg/mL、氯化鈣質(zhì)量濃度20mg/mL、葉綠素亞鐵與海藻酸鈉的質(zhì)量比1:4。

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Preparation and Sustained-release Performance of Chitosan-Sodium Alginate Sodium-Sodium Ferrous Chlorophyllin Microcapsules

MENG Qing-ting，CHEN Wan-dong
(Department of Chemistry and Chemical Engineering, University of Jining, Jining 273155, China)

Sodium ferrous chlorophyllin was microencapsulated into chitosan-sodium alginate micropheres for the purpose of sustained release. The microencapsulation process for sodium ferrous chlorophyllin was optimized using orthogonal array design for achieving both higher entrapment efficiency and drug loading. Meanwhile, the sustained release of the prepared microcapsules in mimic gastric and intestinal environments was observed. The optimal microcapsule formula was found to be composed of 15 mg/mL sodium alginate, 4 mg/mL chitosan and 20 mg/L CaCl2 with a core material/wall material ratio of 1:4. The microcapsules obtained using this formula displayed good sustained-release performance in both mimic environments.

chitosan-sodium alginate sodium-sodium ferrous chlorophyllin microcapsules；drug loading；entrapment efficiency；sustained release

TS201.7；TQ20

A

1002-6630(2010)20-0137-04

2010-01-08

孟慶廷(1964－)，男，副教授，本科，主要從事天然產(chǎn)物功效成分的研發(fā)。E-mail：mqingting@163.com