馬鈴薯蛋白質(zhì)酶解制備多肽工藝優(yōu)化

曹艷萍，楊秀利，薛成虎，代宏哲，賈懷亮

(1.榆林學(xué)院化學(xué)與化工學(xué)院，陜西 榆林 719000；2.濟(jì)南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，山東 濟(jì)南 250022)

馬鈴薯蛋白質(zhì)酶解制備多肽工藝優(yōu)化

曹艷萍1，楊秀利2，薛成虎1，代宏哲1，賈懷亮1

(1.榆林學(xué)院化學(xué)與化工學(xué)院，陜西 榆林 719000；2.濟(jì)南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，山東 濟(jì)南 250022)

以馬鈴薯蛋白質(zhì)為原料，用蛋白酶催化水解制備多肽。以水解度(DH)為評(píng)定指標(biāo)，考察各因素對(duì)水解度的影響。結(jié)果表明，中性蛋白酶為最佳蛋白酶，其他因素對(duì)馬鈴薯蛋白質(zhì)水解度影響的順序?yàn)樗鈺r(shí)間＞水解溫度＞加酶量＞馬鈴薯蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)。最佳工藝條件為馬鈴薯蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)8%、中性蛋白酶(pH7.0)加酶量5.0mg、溫度45℃、水解時(shí)間3h，水解度可達(dá)23.4%。

馬鈴薯蛋白質(zhì)；蛋白酶；水解度；多肽

馬鈴薯營(yíng)養(yǎng)價(jià)值很高，素有“地下蘋果”、“第二面包”、“植物之王”之稱[1-2]。馬鈴薯蛋白的必需氨基酸平衡優(yōu)于其他植物蛋白，與全雞蛋和酪蛋白相當(dāng)，其蛋白質(zhì)的凈消化利用率(PER)可達(dá)到2.3[3]，維持人體氮平衡實(shí)驗(yàn)證明馬鈴薯蛋白質(zhì)優(yōu)于其他作物蛋白質(zhì)[4-5]。肽是參與體內(nèi)代謝的重要物質(zhì)，特別是那些具有特殊生理活性的功能肽近年來(lái)倍受關(guān)注[6]。馬鈴薯中約含3%的蛋白質(zhì)[7-8]，可為人體提供大量的優(yōu)質(zhì)生物活性肽，達(dá)到醫(yī)療保健作用。Pihlanto等[9]用Alcalase、Neutrase和Esperase 3種蛋白酶水解馬鈴薯蛋白質(zhì)，發(fā)現(xiàn)超濾后的水解產(chǎn)物對(duì)血管緊張素轉(zhuǎn)化酶有抑制作用。這種血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑(ACEI)是一種小分子活性肽，能清除超氧陰離子自由基、羥自由基等，可預(yù)防并治療癌癥、動(dòng)脈粥樣硬化和糖尿病等疾病。本實(shí)驗(yàn)對(duì)馬鈴薯蛋白質(zhì)水解制備多肽的工藝條件進(jìn)行研究，找出最佳酶解條件，旨在為馬鈴薯蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)化利用及提高其附加值提供一條可行的途徑。

1 材料與試劑

1.1 材料、試劑與儀器

馬鈴薯蛋白質(zhì) 內(nèi)蒙卓資縣龍的馬鈴薯有限公司；牛血清白蛋白(標(biāo)品) 上海源葉生物科技有限公司；甘氨酸(標(biāo)品) 石家莊石興氨基酸有限公司；考馬斯亮藍(lán)G-250、酸性蛋白酶(pH2.5～4.0，酶活力60000U/g)、中性蛋白酶(pH6.8～8.0，酶活力50000U/g)、堿性蛋白酶(pH8.0～12.0，酶活力10000U/g)、茚三酮、果糖、12水合磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、磷酸二氫鉀、磷酸、醋酸、醋酸鈉(試劑均為分析純)。

722S可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海菁華科技儀器有限公司；80-2型電動(dòng)離心機(jī) 江蘇金壇市環(huán)宇科學(xué)儀器廠；HH-S4A型電子恒溫水浴鍋 北京科偉永興儀器有限公司；PHS-3C精密酸度計(jì) 上海理達(dá)儀器廠；LGJ-18C普通型冷凍干燥機(jī) 北京四環(huán)科學(xué)儀器廠有限公司；H-2050R-1型冷凍離心機(jī) 青島廣青儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 馬鈴薯蛋白質(zhì)水解

稱取適量馬鈴薯蛋白質(zhì)，加入一定量的緩沖液。加熱至所需溫度，恒溫20min，加入一定量的蛋白酶，水解一定時(shí)間后，滅酶(80℃水浴恒溫5min)，離心，上清液即為馬鈴薯蛋白質(zhì)水解液。

1.2.2 水解度的測(cè)定

取一定量的馬鈴薯蛋白質(zhì)水解液于試管中，加入一定量的蒸餾水、顯色劑，混勻定容后，置于沸水浴中加熱15min，同時(shí)作空白實(shí)驗(yàn)。利用式(1)計(jì)算水解度[10-11]：

DH/%=[n/(6.25×N)]/5.1×100 (1)

式中：n為氨基含量/(μmol/mL)；N為蛋白質(zhì)含量/(mg/mL)；5.1為每克馬鈴薯蛋白質(zhì)的肽鍵毫摩爾數(shù)(mmol/g)[12]。

1.2.3 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

采用考馬斯亮藍(lán)G-250法測(cè)定[13]。

1.2.4 氨基含量的測(cè)定

采用茚三酮法測(cè)定[14-15]。

1.2.5 水分的測(cè)定

采用直接干燥法，參照GB 5009.3—2010《食品中水分的測(cè)定》。

1.2.6 灰分的測(cè)定

采用灼燒稱重法，參照GB 5009.4—2010《食品中灰分的測(cè)定》。

1.2.7 牛血清白蛋白的吸光度-質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

稱取0.1000g牛血清白蛋白，溶于蒸餾水并定容至100mL，制成1000μg/mL牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)液，待用；稱取0.1000g考馬斯亮藍(lán)G-250，溶于50mL 95%乙醇中，加入100mL 85%的磷酸，然后用蒸餾水定容至1000mL，制成考馬斯亮藍(lán)溶液。

分別取牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)液0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00mL，各加入考馬斯亮藍(lán)溶液5.00mL，分別用蒸餾水定容至10.00mL，制成分別含牛血清白蛋白0、20、40、60、80、100μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，于595nm處測(cè)定吸光度。以牛血清白蛋白的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.8 甘氨酸的吸光度-質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

稱取0.1000g干燥過(guò)的甘氨酸溶解后定容至100mL，取出4.00mL定容至100mL得40μg/mL甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)液，待用；稱取茚三酮0.5000g、果糖0.3000g、十二水合磷酸氫二鈉12.4000g、磷酸二氫鉀6.0000g，定容至100mL，制成茚三酮顯色劑。

分別取甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)液0.00、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00mL，各加入茚三酮顯色劑1.00mL，40%乙醇定容至10mL，混勻放置15min后于570nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以甘氨酸的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.9 單因素試驗(yàn)

蛋白酶種類采用酸性蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶3種酶，馬鈴薯蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)采用3%、5%、8%、10%、12%五個(gè)水平，水解pH值采用3.6、6.5、7.0、8.0、9.0五個(gè)水平，水解時(shí)間采用2、3、4、5、6h五個(gè)水平，加酶量采用3.0、4.0、5.0、6.0、7.0五個(gè)水平，水解溫度采用35、40、45、50、55℃五個(gè)水平分別進(jìn)行單因素試驗(yàn)。

1.2.10 正交試驗(yàn)

在單因數(shù)試驗(yàn)基礎(chǔ)上，分別選擇馬鈴薯蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)、水解時(shí)間、蛋白酶加入量和水解溫度為考察因素，以水解度為考察指標(biāo)，選用L9(34)正交表設(shè)計(jì)試驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 牛血清白蛋白的吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線

以吸光度為縱坐標(biāo)，牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見(jiàn)圖1。

圖1 牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of bovine serum albumin

標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)r=0.9989，線性范圍為0～100μg/mL，線性方程A=0.0025C+0.0017。

2.2 甘氨酸的吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖2 甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of glycine

如圖2所示，標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)r=0.9976，線性范圍在0～0.266μmol/mL，線性方程：A=0.0457C＋0.0116。

2.3 單因素試驗(yàn)

分別考察蛋白酶種類、馬鈴薯蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)、水解pH值、水解時(shí)間、加酶量以及水解溫度對(duì)馬鈴薯蛋白質(zhì)水解度的影響(每組數(shù)據(jù)重復(fù)做3次，取其平均值)。

2.3.1 蛋白酶種類的影響

選取馬鈴薯蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)8%、水解溫度40℃，分別加入5.0mg酸性蛋白酶(緩沖液pH3.6)、中性蛋白酶(緩沖液pH7.0)、堿性蛋白酶(緩沖液pH9.0)，水解2h，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 蛋白酶種類對(duì)水解度的影響Table 1 Effect of proteases on degree of hydrolysis of potato protein

由表1可知，中性蛋白酶對(duì)馬鈴薯蛋白質(zhì)水解的催化效果最好。這可能是由于pH值的影響，中性條件有利于馬鈴薯蛋白質(zhì)的水解。以下試驗(yàn)均采用中性酶。

2.3.2 馬鈴薯蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

馬鈴薯蛋白質(zhì)分別選取不同的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，水解溫度采用40℃，加入5.0mg中性酶(緩沖液pH7.0)，水解2h，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 馬鈴薯蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)水解度的影響Fig.3 Effect of potato protein concentration on its degree of hydrolysis

由圖3可知，馬鈴薯蛋白質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%時(shí)水解度最大。馬鈴薯蛋白質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)小，水解速度慢，但是馬鈴薯蛋白質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)過(guò)大，酶加入量相對(duì)較小，也不利于水解。所以選取馬鈴薯蛋白質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%為宜。

2.3.3 pH值的影響

選取馬鈴薯蛋白質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%，水解溫度采用40℃，加入5.0mg中性酶，分別采用pH3.6、6.5、7.0、8.0、9.0的緩沖液，水解2h，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 pH值對(duì)水解度的影響Fig.4 Effect of pH on degree of hydrolysis of potato protein

從圖4可以看出，pH6.5～8.0時(shí)，馬鈴薯蛋白質(zhì)水解度相近，pH7.0時(shí)水解度最大，說(shuō)明馬鈴薯蛋白質(zhì)適宜在中性條件下水解。所以選取pH7.0為宜。

2.3.4 水解時(shí)間的影響

選取馬鈴薯蛋白質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%，水解溫度采用40℃，加入5.0mg中性酶，采用pH7.0的緩沖液，水解不同時(shí)間，結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 水解時(shí)間對(duì)水解度的影響Fig.5 Effect of hydrolysis duartion on degree of hydrolysis of potato protein

從圖5可看出，水解3h以后，馬鈴薯蛋白質(zhì)水解度增加不明顯或降低，說(shuō)明水解時(shí)間太長(zhǎng)可能會(huì)引起一些副反應(yīng)。所以水解時(shí)間選取3h為宜。

2.3.5 蛋白酶加入量的影響

圖6 中性蛋白酶加酶量對(duì)水解度的影響Fig.6 Effect of enzyme dose on degree of hydrolysis of potato protein

選取馬鈴薯蛋白質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%，水解溫度采用40℃，加入不同量的中性蛋白酶，采用pH7.0的緩沖液，水解3h，結(jié)果見(jiàn)圖6。

從表6可以看出，隨著加酶量的增加，水解度增大，當(dāng)加酶量超過(guò)5.0mg后，水解度不增反降。酶量過(guò)大，往往會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)太快而出現(xiàn)副反應(yīng)。所以蛋白酶加入量應(yīng)選擇5.0mg。

2.3.6 溫度的影響

選取馬鈴薯蛋白質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%，在不同溫度下，加入5.0mg中性酶，采用pH7.0的緩沖液，水解3h，結(jié)果見(jiàn)圖7。

圖7 溫度對(duì)水解度的影響Fig.7 Effect of hydrolysis temperature on degree of hydrolysis of potato protein

從圖7可看出，水解溫度45℃時(shí)，水解度最大。適當(dāng)提高水解溫度有利于水解，但是水解溫度過(guò)高，會(huì)造成酶失活而不利于水解。所以水解溫度45℃為宜。

2.4 正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)

表2 L9(34)正交試驗(yàn)因素水平表Table 2 Factors and levels in the orthogonal array design

表3 L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Orthogonal array design arrangement and experimental results

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，分別選擇馬鈴薯蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)、水解時(shí)間、蛋白酶加入量和水解溫度為考察因素，以水解度為考察指標(biāo)，選用L9(34)正交表設(shè)計(jì)，因素、水平見(jiàn)表2，L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表3，方差分析見(jiàn)表4。

表4 方差分析Table 4 Variance analysis for degree of hydrolysis of potato protein with various hydrolysis conditions

由表3極差R大小可知，4個(gè)影響因素的主次順序?yàn)锽＞D＞C＞A，即：水解時(shí)間＞水解溫度＞加酶量＞馬鈴薯蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)?？梢?jiàn)，水解時(shí)間對(duì)水解度影響最大，其次是水解溫度，加酶量也有一定的影響，馬鈴薯蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)在所選水平范圍內(nèi)對(duì)水解度影響很小。由表4可知，水解時(shí)間和水解溫度對(duì)水解度的影響顯著，加酶量對(duì)水解度的影響不顯著。在所選因素水平下，4種因素的最佳組合應(yīng)為A1B2C2D2，在該組合的條件下馬鈴薯蛋白質(zhì)水解度較高，為23.4%。

2.5 酶解產(chǎn)物多肽成分的理化指標(biāo)

在上述最佳工藝條件下水解得到的水解液在15000 r/min離心10min后，取上清液凍干成粉。觀察其顏色、外觀及其溶解性并測(cè)定其常規(guī)成分。其產(chǎn)品為灰白色粉末，在水中極易溶解。產(chǎn)品總蛋白含量70.26%、灰分4.12%、水分4.97%。

3 結(jié) 論

馬鈴薯蛋白質(zhì)水解制備多肽的最佳工藝條件為馬鈴薯蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)8%，加入5.0mg中性蛋白酶(緩沖溶液pH7.0)，在45℃溫度下水解3h，水解度可達(dá)23.4%。所得產(chǎn)品總蛋白含量70.26%、灰分4.12%、水分4.97%。

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Enzymatic Preparation of Polypeptides from Potato Protein

CAO Yan-ping1，YANG Xiu-li2，XUE Cheng-hu1，DAI Hong-zhe1，JIA Huai-liang1
(1. School of Chemistry and Chemical Engineering, Yulin University, Yulin 719000, China；2. School of Chemistry and Chemical Engineering, University of Jinan, Jinan 250022, China)

In this work, potato protein was used as the raw material to prepare polypeptides by enzymatic hydrolysis. The effects of four process conditions on the degree of hydrolysis of potato protein were explored. Neutral protease was the best choice for the hydrolysis of potato protein. Hydrolysis duration was found to be the most critical process condition, followed by hydrolysis temperature, enzyme dose and substrate concentration. The optimal values of the four process conditions were determined as follows: substrate concentration, 8%; hydrolysis temperature, 45 ℃; enzyme dose, 5.0 mg; and hydrolysis duration,3 h. The degree of hydrolysis of potato protein was as high as 23.4% under such hydrolysis conditions.

potato protein；protease；degree of hydrolysis；polypeptide

TS201.21

A

1002-6630(2010)20-0246-05

2010-06-27

陜西省教育廳資助項(xiàng)目(08JK507)

曹艷萍(1958—)，女，教授，本科，主要從事有機(jī)合成及天然物質(zhì)應(yīng)用方面的研究。E-mail：caoyp_0923@163.com