裂解性福氏志賀氏菌噬菌體SF-A2的生物學特性及其在巴氏殺菌牛奶中的滅菌效果

張 輝，王 冉*，包紅朵

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學院 農(nóng)業(yè)部食品安全監(jiān)控重點開放實驗室，江蘇省食品質量安全重點實驗室-省部共建國家重點實驗室培育基地，江蘇省畜禽產(chǎn)品安全性研究重點實驗室，江蘇 南京 210014)

裂解性福氏志賀氏菌噬菌體SF-A2的生物學特性及其在巴氏殺菌牛奶中的滅菌效果

張 輝，王 冉*，包紅朵

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學院 農(nóng)業(yè)部食品安全監(jiān)控重點開放實驗室，江蘇省食品質量安全重點實驗室-省部共建國家重點實驗室培育基地，江蘇省畜禽產(chǎn)品安全性研究重點實驗室，江蘇 南京 210014)

分離裂解性福氏志賀氏菌(Shigella flexneri)噬菌體，鑒定其生物學特性，研究其在巴氏殺菌牛奶的滅菌效果。以福氏志賀氏菌為宿主菌，從污水中分離獲得特異性針對福氏志賀氏菌的具有高裂解活性的噬菌體，命名為SF-A2。運用PEG/NaCl法純化SF-A2，經(jīng)負染后電鏡觀察，該噬菌體為肌尾科噬菌體。生物學特性分析表明：該噬菌體特異性針對福氏志賀氏菌，且對溫度及pH值具有良好的耐受能力。將SF-A2以高感染復數(shù)(103)用于即食性食品(牛奶)中的福氏志賀氏菌的生物防控實驗。結果表明：SF-A2能夠有效滅菌，在加入48h后，福氏志賀氏菌降低了3lg(CFU/mL)；作用至72h，能夠完全將福氏志賀氏菌滅活。從而表明，裂解性福氏志賀氏菌噬菌體SF-A2具有良好的殺菌能力，能夠在食品中防控福氏志賀氏菌的污染，也為防治由福氏志賀氏菌引起的腹瀉性疾病提供生物源性治療源。

裂解性福氏志賀氏菌；噬菌體；生物防控

志賀氏菌(Shigella)是胃腸疾病感染的主要病原菌之一，能夠導致嚴重的腹瀉。2005年，世界衛(wèi)生組織發(fā)布的數(shù)據(jù)顯示，各種腹瀉引起的疾病約有8000萬例，約70萬人死亡[1]。而致病原因主要是由于誤食志賀氏菌污染的食品、水所致。志賀氏菌屬分4個種，其中福氏志賀氏菌(Shigella flexneri，S. flexneri) 是發(fā)展中國家痢疾發(fā)病的優(yōu)勢菌[2]。有關資料顯示，食品中志賀氏菌污染呈現(xiàn)日益嚴重趨勢，玉溪市餐飲業(yè)衛(wèi)生調(diào)查從芫荽中出檢出志賀氏菌6型[3]；2006年，重慶南川市發(fā)生食物中毒事件，其原因是食用福氏志賀氏菌污染的食物所致[4]，控制食品中志賀氏菌的污染已刻不容緩。

噬菌體是一類病毒，對一些特定細菌具有高度的專一性，當噬菌體侵染細菌時，可在細菌中繁殖并殺死細菌，但其對動植物或人體本身沒有毒性。因此，噬菌體以其特有的自然特征有望成為較理想的抗菌藥[5]和新型生物殺菌制劑。目前已有噬菌體用于食品生物防控的報道，如用空腸彎曲菌(Campylobacter jejuni)噬菌體滅活雞體表的空腸彎曲菌[6]；沙門菌噬菌體PHL4用于控制沙門菌在生禽中的污染[7]；Guenther等[8]將毒性噬菌體A511和P100混合用于固體和液體食品的殺菌研究，證實其能夠有效殺滅和控制即食性食品中的單核細胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes，Lm)污染；Carcí a等[9]還將金黃色葡萄球菌噬菌體Φ88和Φ35混合后用于控制凝乳加工過程中的金黃色葡萄球菌污染等。目前，美國FDA已批準噬菌體作為食品添加劑用于殺滅食品中的李斯特菌[10]。因此，本研究以引起腹瀉的主要病原福氏志賀菌作為宿主菌，分離特異的福氏志賀氏菌噬菌體，初步分析其生物學特性，并在食品中進行噬菌體生物防控研究。

1 材料與方法

1.1 材料、菌種與培養(yǎng)基

巴氏殺菌牛奶 南京衛(wèi)崗乳業(yè)有限公司。

福氏志賀氏菌(CMCC 51572) 廣州微生物研究所菌種保藏中心；大腸桿菌(ATCC 25922) 杭州天和微生物試劑有限公司；腸炎沙門氏菌(ATCC 13076)由揚州疾病預防控制中心巢國祥博士惠贈；福氏志賀氏菌分離株由江西省農(nóng)業(yè)科學院曾艷兵惠贈。

營養(yǎng)肉湯、LB培養(yǎng)基 青島高科園海博生物技術有限公司；NaCl、Tris、氯仿、CaCl2(均為生化試劑)汕頭市西隴化工廠有限公司。

1.2 方法

1.2.1 噬菌體分離

污水樣取自鮮肉加工車間。將污水用雙層濾紙過濾，除去大量雜質；再將濾液用無菌濾器(0.22μm)除菌；取50mL過濾液，同時加入2mL噬菌體宿主菌(CMCC 51572)過夜培養(yǎng)物，然后加入CaCl2溶液(100mmol/L)至終濃度為1mmol/L，混勻，置于室溫作用30min，再放置于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜。次日，取上述培養(yǎng)物以12000r/min離心30min，取上清；12000r/min再次離心20min，取上清并加入數(shù)滴氯仿，此即為噬菌體原液。

1.2.2 噬菌體原液單層平板實驗

將營養(yǎng)瓊脂平板分為2個區(qū)域：吸取宿主菌液0.1mL滴于平板正中央，將菌液均勻涂開；待其晾干后，取噬菌體原液0.05mL滴于其中一個區(qū)域，并涂布均勻；待晾干后，倒置于37℃溫箱培養(yǎng)10h后，觀察兩個區(qū)域的變化。同時以噬菌體原液作對照，以鑒定噬菌體中是否含有宿主菌。

1.2.3 噬菌體雙層平板及效價測定

取噬菌體原液0.1mL，進行10倍稀釋，取10-4、10-6稀釋液各0.1mL與0.1mL宿主菌過夜培養(yǎng)物混勻，室溫吸附15min后，加入約5mL 0.7%瓊脂的LB培養(yǎng)基，混勻后迅速傾倒入LB平板上，平置5min，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，12h后觀察噬菌斑形成情況。

1.2.4 噬菌體純化

在形成噬菌斑的雙層平板上挑取形態(tài)大小一致的單個噬菌斑，用接種針穿刺目的噬菌斑，將穿刺后接種針伸入3～5mL LB培養(yǎng)基中，重復3～5次后，加入噬菌體宿主菌液0.1mL，混勻，室溫作用15min，37℃培養(yǎng)10～14h，4℃、12000r/min離心20min，取上清，同時加入0.1mL氯仿，室溫作用20min，無菌過濾上清，同1.2.3節(jié)方法測定純化噬菌體的效價。將純化的噬菌體懸液經(jīng)PEG/NaCl處理后[11]，4℃、12000r/min離心40min，取上清，用1L的SM(sodium-magnesium)溶液(NaCl 100mmol/L、MgSO4·7H2O 10mmol/L、Tris-HCl(pH7.5) 0.05mol/L)溶解沉淀，即為濃縮液。

1.2.5 噬菌體電鏡觀察

取純化的噬菌體濃縮液0.01mL，以2%磷鎢酸(pH7.0)進行負染色5～10min，通過透射電鏡進行觀察。

1.2.6 噬菌體感染復數(shù)(multiplicity of infection，MOI)

將宿主菌培養(yǎng)至對數(shù)生長期，測定OD600nm，并以此將其濃度調(diào)整為2×107CFU/mL，按照不同MOI加入噬菌體和宿主菌的比例分別為100:1、10:1、1:1、1:10、1:100、1:1000，加入液體培養(yǎng)基調(diào)整每管總體積相同，37℃、150r/min培養(yǎng)4h后，再經(jīng)10000r/min離心10min，取上清液測其效價，每個MOI均作2～3個重復。以產(chǎn)生最高噬菌體效價的MOI為最佳MOI。

1.2.7 噬菌體一步生長曲線實驗

方法詳見參考文獻[12]。

1.2.8 噬菌體熱穩(wěn)定性和pH值穩(wěn)定性的測定

取0.1mL 1×108PFU/mL 純化噬菌體分別于40～90℃水浴作用30min和1h，并立即將樣品冰浴冷卻后測其效價；分別取pH4.0～10.0的蛋白胨水和2×109PFU/mL純化噬菌體等量混合，37℃水浴作用2h后測其效價。

1.2.9 噬菌體宿主譜分析

分別取0.1mL 105、106純化噬菌體稀釋液與大腸桿菌、腸炎沙門氏菌和福氏志賀氏菌分離株各0.1mL混勻，室溫放置15min后，上層加入含0.7%瓊脂的LB培養(yǎng)基約5mL，將該混合液迅速傾倒入下層LB培養(yǎng)基平板上，37℃溫箱培養(yǎng)10～12h后觀察噬菌斑形成情況。

1.2.10 噬菌體SF-A2在食品中的滅菌實驗

將宿主菌靜置過夜培養(yǎng)，次日測定其OD600nm，用SM溶液將其濃度調(diào)整為5×105CFU/mL。設A組為實驗組：分別取100μL菌液加入5mL巴氏殺菌牛奶中，同時加入100μL(用SM調(diào)整至5×108PFU/mL)純化的SF-A2噬菌體稀釋液，將其充分混勻；B組為對照組：取100μL菌液加入5mL巴氏殺菌牛奶中，不加噬菌體；C組為空白對照：取100μL SM加入5mL巴氏殺菌牛奶中，不加噬菌體；以上3組接種后室溫作用15min立即置于4℃，分別于0、2、24、48h和72h檢測噬菌體的滅菌效果。

2 結果與分析

2.1 福氏志賀氏菌噬菌體的分離、鑒定及效價測定結果

在單層平板實驗中，涂有噬菌體原液的區(qū)域沒有細菌生長，而涂宿主菌液未涂噬菌體原液的區(qū)域有細菌生長。從而說明，噬菌體原液中可能含有對福氏志賀氏菌特異的噬菌體，且效價較高。將噬菌體原液進行倍比稀釋后，進行雙層平板實驗，次日，平板中有噬菌斑形成(圖1)。計數(shù)10-6稀釋液平板中的噬菌斑，計算得出此噬菌體原液的效價為2.1×109PFU/mL。將雙層平板中大小一致的噬菌斑進行進一步純化，并進行進一步的效價測定。結果純化的噬菌體效價為3.0×109PFU/mL，再經(jīng)PEG/NaCl法沉淀后，其效價為7.5×1010PFU/mL，有利于進一步實驗的進行。

圖1 噬菌體雙層平板檢測結果Fig.1 Phage test results using double layer agar medium plate

2.2 噬菌體電鏡觀察結果

透射電鏡觀察純化的噬菌體濃縮液，結果見圖2。該噬菌體有立體對稱的頭部，直徑約為44.4nm，具有可伸縮性尾，尾長約168.9nm(尾部在制備過程中有部分脫落)。按照國際病毒分類委員會(International Committee on Taxonomy of Viruses，ICTV)分類規(guī)則，將該噬菌體歸類為肌尾病毒科，并命名為SF-A2。

圖2 福氏志賀氏菌噬菌體SF-A2電鏡圖Fig.2 Electron micrograph of S. flexneri phage SF-A2

2.3 噬菌體最佳MOI

表1 福氏志賀氏菌噬菌體最佳MOI測定結果Table 1 Determination of optimal multiplicity of infection (MOI)

由表1可知，當MOI為10:1和1:1時，噬菌體效價分別為2.84×109PFU/mL和1.73×109PFU/mL，產(chǎn)生的子代噬菌體數(shù)量較高，因此噬菌體擴增應選擇MOI為10:1時最佳。

2.4 噬菌體一步生長曲線

圖3 噬菌體SF-A2一步生長曲線Fig.3 One-step growth curve of phage SF-A2

由圖3可見，福氏志賀氏菌噬菌體SF-A2感染宿主菌的潛伏期約為10min，平均裂解量為53.5(裂解量=爆發(fā)期噬菌體滴度/感染初期宿主菌濃度)，具有高裂解活性。

2.5 噬菌體熱穩(wěn)定性和pH值穩(wěn)定性

圖4 溫度和pH值對噬菌體活性的影響Fig.4 Effect of temperature and pH on the activity of phage SF-A2

如圖4a所示，噬菌體在40℃和50℃分別作用30min和60min后，其活性無明顯變化；60℃作用1h，活性有所降低；70℃作用后，效價降低至初始效價的50%以下；至9 0℃，幾乎失活。如圖4b所示，噬菌體在pH5.0～9.0內(nèi)，其效價均在109PFU/mL以上，其活性無明顯變化；當pH4.0時，其效價降至108PFU/mL；pH10.0時，其效價迅速降低，表明SF-A2對酸和堿有一定的耐受力。

2.6 噬菌體寬噬實驗

大腸桿菌及沙門氏菌在雙層平板上層培養(yǎng)基生長均勻，無噬菌斑形成，而福氏志賀氏菌分離株中有噬菌斑，說明分離的噬菌體對福氏志賀氏菌特異。

2.7 噬菌體在巴氏殺菌牛奶中的滅菌效果

圖5 噬菌體SF-A2在巴氏殺菌牛奶中的滅菌效果Fig.5 Inactivation of S. flexneri in milk by phage SF-A2

將噬菌體以較高MOI(103)用于巴氏殺菌牛奶滅菌，結果如圖5所示，在室溫吸附15min后，立即測定不同組的宿主菌數(shù)量，結果在0h，加入噬菌體組的宿主菌數(shù)量有所下降；作用2h后，再進行檢測，實驗組中宿主菌與對照組相比較顯著下降(約下降2lg(CFU/mL))；24h后，對照組宿主菌數(shù)量無顯著變化，但實驗組仍有減少；至48h，實驗組與對照組相比較，宿主菌數(shù)量下降約3lg(CFU/mL)；至72h，實驗組中已檢測不到宿主菌，而對照組宿主菌中數(shù)量仍持續(xù)在起始水平。SM對照組在實驗始末均未檢測到宿主菌及噬菌體。

3 討 論

志賀氏菌是重要的食源性病原菌之一，可以通過糞-口傳染、也可通過污染的食物、水等傳播。目前，臨床上主要以抗菌藥物和補液治療痢疾，但由于志賀氏菌對抗生素日趨耐藥，嚴重影響了治療效果。噬菌體用于食品生物防控和治療已成為目前的研究熱點。噬菌體廣泛存在于自然界中，其多樣性尤其驚人，在生物圈中其數(shù)量達1031之巨[13]。與傳統(tǒng)的抗生素相比較，噬菌體具有特異殺菌、不產(chǎn)生抗性等特點。因此，本研究分析了分離獲得的福氏志賀氏菌噬菌體SF-A2的基本生物學特性，并將其應用于即食性食品，進行噬菌體殺菌效果研究。

本研究中所分離的噬菌體SF-A2特異性針對福氏志賀菌2a血清型，宿主譜較窄[14]，為裂解性噬菌體。且當Ca2+濃度為1mmol/L時，噬菌體對宿主吸附能力最佳[15]，效價可達109～1010PFU/mL。當噬菌體與宿主菌以MOI為10:1接種時，效價較高，為制備噬菌體源提供了必要的前提。在一步生長曲線中可以看出，噬菌體SF-A2潛伏期較短，而在大腸桿菌噬菌體研究中潛伏期平均為25～27min[16]，同樣黏質沙雷氏菌裂解性噬菌體的潛伏期也為30min[15]，而本研究中噬菌體SF-A2的潛伏期較短，約為10min。此外，電鏡觀察顯示，該噬菌體為肌尾噬菌體，為雙鏈DNA[14]，具有傳統(tǒng)裂解性噬菌體生物學特性。

噬菌體用于食品生物防控已有報道，噬菌體SF-A2對溫度及pH值具有一定的耐受能力，而通常即食性食品的pH值中性偏酸，因此，SF-A2對酸的耐受有利于在食品殺菌過程中保持必要的活性。對牛奶中福氏志賀氏菌的殺菌效果表明，SF-A2能夠有效滅菌，在作用48h后，宿主菌減少了3lg(CFU/mL)，而在72h，已檢測不到宿主菌。這一結果表明，噬菌體SF-A2具有良好的殺菌效力，且在作用72h后噬菌體數(shù)量仍持續(xù)在107PFU/mL(數(shù)據(jù)未顯示)。綜上所述，本實驗所分離噬菌體用于生物防控是切實可行的，其高效殺菌以及無毒副作用的前提將優(yōu)于其他化學制品。噬菌體用于控制食品中食源性病原污染的研究屢見不鮮，如在大腸桿菌O157[17]、沙門氏菌[18]等，然而目前未見志賀氏菌噬菌體用于食品生物防控的報道，因此本研究將為今后噬菌體作為食品添加成分用于食品生物防控殺菌制劑的開發(fā)提供有力的實驗依據(jù)。目前，荷蘭已有商品化噬菌體產(chǎn)品LISTEXTM P100作為食品中的生物殺菌劑，且FDA已批準噬菌體有機制應用于食品，美國農(nóng)業(yè)部還批準Omnilytics公司生產(chǎn)的以噬菌體為主的殺菌劑用于殺滅宰前動物中污染的大腸桿菌O157:H7及沙門氏菌等，因此，噬菌體作為新型食品生物防控制劑具有廣闊的開發(fā)和應用前景。

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Biological Characteristics of Lytic SF-A2 Phage and Its Sterilization Effect in Milk

ZHANG Hui，WANG Ran*，BAO Hong-duo
(Key Laboratory of Agro-Food Safety and Quality, Ministry of Agriculture, Key Laboratory of Food Quality and Safety of Jiangsu Province-State Key Laboratory Breeding Base, Key Laboratory of Animal-derived Food Safety of Jiangsu Province, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014, China)

In order to analyze biological characteristics ofShigella flexneri(S. flexneri) phage and its sterilization effect in milk,the lyticS. flexneriphage SF-A2 was isolated from sewage. Electron microscope observation showed that purified phage SF-A2 was a member of family Myoviridae. Based on its biological characteristic assay, phage SF-A2 exhibited the tolerance to temperature and pH. In addition, phage SF-A2 could effectively inactivateS. flexneri. After adding phage SF-A2 for 48 h, the concentration ofS. flexneriwas reduced by 103 folds compared with the host control. After 72 h incubation, the concentration ofS. flexneriwas declined to the limit of detection. Therefore, SF-A2 is a virulent bacteriophage and can effectively inactivateS. flexneriin ready-to-eat milk. It will be a good biological control agent for food safety and also an efficient antimicrobial source for diarrhea.

Shigella flexneri；bacteriophage；biological control

TS201.3； Q939.48

A

1002-6630(2010)23-0214-05

2010-09-19

江蘇省自然科學基金項目(BK2009328)；江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新項目(cx(10)438)

張輝(1978—)，女，助理研究員，博士，主要從事食源性病原菌的監(jiān)測及生物防控研究。E-mail：HZ581200@yahoo.com.cn

*通信作者：王冉(1973—)，女，副研究員，博士，主要從事畜禽產(chǎn)品安全及監(jiān)控研究。E-mail：wangran2001@126.com