殼聚糖偶聯(lián)Cy3復(fù)合探針制備條件優(yōu)化及光譜特性分析

王義啟，費學(xué)寧，谷迎春，孟慶洋

(天津城市建設(shè)學(xué)院 材料科學(xué)與工程系，天津 300384)

熒光染料是一種廣泛使用的熒光標(biāo)示劑(又稱為熒光探針)，它提供了比傳統(tǒng)的同位素檢測更實用、更安全的DNA片段標(biāo)記方法，具有檢測速度快、重復(fù)性好、用樣量少、無輻射且可實現(xiàn)測序的實時、在線、計算機處理等優(yōu)點.在DNA自動測序、抗體免疫分析、疾病診斷、抗癌藥物分析等方面已得到廣泛應(yīng)用[1-4].菁染料Cy3作為生物熒光探針分子，具有可修飾性強、吸光系數(shù)高、吸收波長可調(diào)范圍大等優(yōu)點[5]，是性能優(yōu)良的熒光標(biāo)記染料，廣泛用于抗體、核酸及其他生物分子的標(biāo)記和檢測[6-7].

殼聚糖是甲殼素的脫乙?；a(chǎn)物，是天然多糖中唯一的堿性多糖，它具有良好的生物相容性、生物可降解性及獨特的跨細胞膜能力[8].殼聚糖鏈中的伯胺基團很容易和生物分子發(fā)生反應(yīng)，如：蛋白質(zhì)、DNA、酶、抗原抗體、生物素以及熒光分子異硫氰酸酯等.因此，殼聚糖逐漸成為生物醫(yī)學(xué)工程領(lǐng)域研究較多的材料之一[9].

本文通過菁染料 Cy3探針對殼聚糖的偶聯(lián)，分析了其不同條件下的偶聯(lián)規(guī)律及Cy3-CTS探針的光譜特性.菁染料 Cy3偶聯(lián)殼聚糖的熒光探針分子不僅具備殼聚糖生物相容性和生物可降解性等優(yōu)點，而且具備熒光染料光譜范圍廣、摩爾消光系數(shù)高和較高的熒光量子產(chǎn)率等優(yōu)點，還進一步改善了熒光探針分子的靈敏度[10].

1 實驗部分

1.1 主要試劑和儀器

主要試劑殼聚糖(相對分子質(zhì)量 2000，3000，5000，濟南海得貝海洋生物工程公司)，二異丙基乙胺(DIEA，吉爾生化生物有限公司)，1-羥基苯并三唑(HOBT，吉爾生化生物有限公司)，O-苯并三唑-N，N，N'，N'-四甲基脲六氟磷酸鹽(HBTU，吉爾生化生物有限公司)；其它試劑均為分析純.Cary Eclipse熒光分析儀(VARINA)，紫外分光光度計(UV2550，日本島津).

1.2 殼聚糖(CTS)偶聯(lián)Cy3的制備

菁染料Cy3根據(jù)文獻[11]制備.

將適量 Cy3完全溶在二甲基甲酰胺(DMF)中，加入縮合劑HBTU、HOBT和DIEA(1∶1∶2)溶解完全，向溶液中加入殼聚糖水溶液(0.5 g/10 mL)，一定溫度下攪拌一段時間.反應(yīng)結(jié)束后，加入乙醚萃取三次，水相再用乙酸乙酯洗滌后加入丙酮，析出大量固體.用索氏提取器萃取，干燥得到紅色固體.

1.3 Cy3-CTS制備條件的優(yōu)化

通過用紫外分光光度計掃描 Cy3和 Cy3-CTS的最大吸收波長發(fā)現(xiàn)：Cy3與 Cy3-CTS有相同的紫外特征峰，最大紫外吸收波長均為 548 nm，且峰形一致，如圖1所示.由于Cy3偶聯(lián)殼聚糖后紫外吸收波長不受影響，因此可以利用 Cy3的紫外吸收強度與濃度的線性關(guān)系，確定殼聚糖修飾后的染料中所含Cy3的相對量.

圖1 CTS-Cy3和Cy3的紫外吸收光譜

1.3.1 Cy3標(biāo)準曲線的繪制

分別稱取 1，2，3，4，5 mg 染料 Cy3，放置于 1 L容量瓶中，用去離子水溶解配置不同濃度的標(biāo)準溶液，用紫外分光光度計分別測定 548 nm處的吸光度.以染料濃度對吸光度做標(biāo)準曲線，如圖2所示.

圖2 Cy3的標(biāo)準曲線

1.3.2 Cy3與殼聚糖偶聯(lián)比的計算

不同條件下，復(fù)合探針CTS-Cy3偶聯(lián)Cy3數(shù)量的相對量不同.將一定濃度的 CTS-Cy3水溶液在紫外分光光度計上測定548 nm 處的吸光度，然后在標(biāo)準曲線上找到相應(yīng)的 Cy3濃度，按下式計算出 Cy3-CTS的偶聯(lián)比

式中：M為Cy3的相對摩爾數(shù)；M0為CTS-Cy3的總摩爾數(shù).

2 結(jié)果與討論

菁染料Cy3上的羧基經(jīng)過活化劑活化后很容易與殼聚糖分子鏈上的氨基縮合，生成穩(wěn)定的酰胺鍵，從而使菁染料與殼聚糖偶聯(lián)得到新的復(fù)合探針分子，如圖3所示.

2.1 CTS-Cy3偶聯(lián)比條件的優(yōu)化

在制備 CTS-Cy3的過程中，反應(yīng)時間、溫度、原料CTS與Cy3的比例以及殼聚糖的相對分子質(zhì)量都對 CTS-Cy3的偶聯(lián)比有較大影響，因此通過改變上述制備條件來比較不同CTS-Cy3的偶聯(lián)比.

2.1.1 時間對CTS-Cy3偶聯(lián)比的影響

在不改變溫度和原料比例的情況下，分別計算1，4，10，24，48 h等不同時間制備的復(fù)合探針 CTSCy3偶聯(lián)比，CTS-Cy3偶聯(lián)比隨時間變化的曲線如圖4所示.

圖3 CTS-Cy3反應(yīng)示意圖

圖4 Cy3-CTS的偶聯(lián)比隨時間的變化曲線

從圖4可以看出：開始CTS與Cy3的反應(yīng)速度很快，殼聚糖上的氨基很容易與活化的羧基 Cy3反應(yīng)生成穩(wěn)定的酰胺鍵；隨時間增長，殼聚糖偶聯(lián) Cy3的數(shù)量隨之增多，然而 20 h后殼聚糖偶聯(lián)染料數(shù)增長緩慢.分析認為主要原因是隨著殼聚糖偶聯(lián)染料數(shù)量的增多，空間位阻增大，從而不利于其他酰胺反應(yīng)，致使CTS-Cy3的偶聯(lián)比不增.所以20 h為最佳反應(yīng)時間.

2.1.2 溫度對CTS-Cy3偶聯(lián)比的影響

保持反應(yīng)時間和原料比例不變，分別計算不同溫度下制備的CTS-Cy3偶聯(lián)比，繪制CTS-Cy3偶聯(lián)比隨溫度的變化曲線如圖5所示.

圖5 Cy3-CTS的偶聯(lián)比隨溫度的變化曲線

從圖5可以看出：隨溫度的上升殼聚糖氨基活性增強，殼聚糖偶聯(lián) Cy3的數(shù)量隨之增多；在 70 ℃后，CTS-Cy3的偶聯(lián)比有所下降.原因可能由于溫度過高，導(dǎo)致殼聚糖大分子活性降低，降低自由基引發(fā)能力，不利于酰胺反應(yīng)的發(fā)生，而高溫下酰胺鍵的不穩(wěn)定性可能導(dǎo)致 CTS-Cy3偶聯(lián)比的下降.因此從圖 5中可以直觀地看出70 ℃為反應(yīng)最佳溫度.

2.1.3 殼聚糖與 Cy3投料比例對 CTS-Cy3偶聯(lián)比的影響

保持反應(yīng)時間和反應(yīng)溫度不變，分別計算不同比例原料投量下制備的CTS-Cy3偶聯(lián)比，繪制 CTSCy3偶聯(lián)比隨原料投料比例的變化曲線，如圖6所示.

圖6 Cy3-CTS的偶聯(lián)比隨原料比例的變化曲線

從圖6可以看出：隨著 Cy3濃度的增大，溶液體系擴散加快，酰胺反應(yīng)點增多，所以殼聚糖偶聯(lián)染料的數(shù)量隨之增多，偶聯(lián)比增大；在 1∶2之后，CTSCy3的偶聯(lián)比增長緩慢.這是因為隨著染料濃度的增加，體系的黏度增大，單體難以擴散到偶聯(lián)活性中心，導(dǎo)致染料在殼聚糖溶液的溶解度降低，直接沉降下來，致使CTS-Cy3的偶聯(lián)比不增[12].所以1∶2為最佳投料比例.

2.1.4 殼聚糖的相對分子質(zhì)量對CTS-Cy3偶聯(lián)比的影響

保持溫度、時間和原料投量比例不變，增加 CTS的鏈長，相對分子質(zhì)量 3000的殼聚糖偶聯(lián)比為13.74%與相對分子質(zhì)量 2000的相比增加兩個百分點，相對分子質(zhì)量5000的殼聚糖偶聯(lián)比為29.6%.隨殼聚糖碳鏈的增長，空間位阻小，產(chǎn)生的自由基增多，引發(fā)染料偶聯(lián)殼聚糖共聚物增多，所以偶聯(lián)比隨相對分子質(zhì)量的增大而增大；但由于偶聯(lián)比增大，氫鍵作用增大，致使產(chǎn)物的水溶性不好，不利于以后產(chǎn)物作為探針對細胞的標(biāo)記.因此認為相對分子質(zhì)量 3000的殼聚糖為制備復(fù)合探針原料的最佳選擇.

綜上所述，CTS-Cy3制備的最佳條件為：70 ℃下，相對分子質(zhì)量為 3000的殼聚糖與 Cy3比例為1∶2，反應(yīng)20 h所得的復(fù)合探針分子CTS-Cy3.

2.2 殼聚糖偶聯(lián)Cy3的光譜特性

配置一定濃度Cy3的標(biāo)準溶液和等當(dāng)量Cy3摩爾濃度相同的 CTS-Cy3標(biāo)準溶液儲存?zhèn)溆?用熒光分光光度計測定對比 Cy3和 Cy3-CTS的熒光發(fā)射光譜，熒光掃描激發(fā)波長為 548 nm，激發(fā)狹縫 5 nm，發(fā)射狹縫5 nm，發(fā)射光譜如圖7所示，Cy3-CTS的熒光光譜數(shù)據(jù)如表1所示.

圖7 Cy3和CTS-Cy3的熒光光譜

表1 Cy3和Cy3-CTS的熒光光譜數(shù)據(jù)

從圖 7及表 1可以看出：Cy3偶聯(lián)殼聚糖后，熒光最大吸收波長不變，而熒光強度明顯增強，優(yōu)化后CTS-Cy3的 stocks位移無明顯變化，而量子產(chǎn)率增加1.5倍，說明CTS-Cy3相對Cy3有熒光加合增效.

3 結(jié) 論

將菁染料 Cy3偶聯(lián)殼聚糖得到復(fù)合探針，并研究其制備過程中不同條件下的偶聯(lián)規(guī)律及光譜特性.研究表明：在 70 ℃以下，相對分子質(zhì)量為 3000的殼聚糖與 Cy3的比例為1∶2、反應(yīng)20 h得到的復(fù)合探針最佳.通過紫外及熒光光譜發(fā)現(xiàn)，殼聚糖復(fù)合探針與菁染料具有相同的最大紫外吸收波長，且有明顯的熒光加合增效.CTS-Cy3復(fù)合探針具備菁染料光譜范圍廣、摩爾消光系數(shù)高和較高的熒光量子產(chǎn)率等優(yōu)點，為用于進一步改善熒光探針分子的靈敏度方面提供了工作基礎(chǔ).

［1］CHEN X Y，PENG X J. DNA fluorescence probes[J].Dyestuffs and coloration，2004，41(6)：315-319.

［2］欒吉梅，張曉東. 熒光光度法測定核酸的研究進展[J].理化檢測：化學(xué)分冊，2007，43(3)：241-245.

［3］宋宏濤，楚士晉. 核酸測定中的有機熒光探針[J]. 生物學(xué)雜志，2010，27(1)：72-75.

［4］SUN W，LI Q J，JIAO K，et al. Interaction of small organic molecules with DNA and its analytical application[J]. Chemical Reagents，2005，27(3)：149-152.

［5］孫成才，霍冀川，雷永林，等. 近紅外吸收功能菁染料的研究進展[J]. 材料導(dǎo)報，2006，20(8)：48-51.

［6］CARREON J R，MAHON Jr KP，KELLEY SO. Thiazole orange-peptide conjugates：sensitivity of DNA binding to chemical structure[J]. Org Lett，2004，6(4)：517-519.

［7］KOHLER O，SEITZ O. Thiazole orange as flurescent universal base in peptide nucleic acids[J]. Chem Commun , 2003，7(23)：2938-2939.

［8］蔣挺大. 甲殼素[M]. 北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2003：3.

［9］KHOR E，LIRA LY. Implantable applications of chitin and hitosan[J]. Biomaterials，2003，24(13)：2339-2349.

［10］劉志軍，費學(xué)寧，谷迎春. 殼聚糖支載菁染料熒光探針及熒光特性[J]. 影像科學(xué)與光化學(xué)，2009，27(4)：307-313.

［11］樓開炎，錢旭紅，宋恭華. 不對稱水溶性菁染料的簡便制備與純化方法[J]. 華東理工大學(xué)學(xué)報，2002，28(2)：212-215.

［12］鄭 靜，王俊卿，蘇致興. 殼聚糖與 N-異丙基丙烯酰胺接枝共聚[J]. 應(yīng)用化學(xué)，2003，20(2)：1204-1207.