周期性張應(yīng)變力對(duì)幼年和成年及骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞產(chǎn)生糖胺多糖的影響

商鵬 陳維毅 衛(wèi)小春 李曉娜

骨關(guān)節(jié)炎(OA)是關(guān)節(jié)疾病中最常見的類型之一。流行病學(xué)調(diào)查顯示中老年人群中，60%有明顯OA的影像學(xué)改變。疾病主要累及負(fù)重的大關(guān)節(jié)，其病理過程以關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)的降解破壞為特征，1995年國際OA專題會(huì)議提出了OA的最新定義，認(rèn)為OA是力學(xué)和生物學(xué)因素共同作用下導(dǎo)致軟骨細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)以及軟骨下骨三者降解和合成正常偶聯(lián)失衡的結(jié)果。可見，軟骨細(xì)胞代謝的改變是OA病變發(fā)展的關(guān)鍵。而軟骨細(xì)胞合成、分泌基質(zhì)活動(dòng)受到機(jī)械應(yīng)力的調(diào)控，異常的應(yīng)力刺激會(huì)造成軟骨細(xì)胞功能下降、失調(diào)，使基質(zhì)合成減少，失去正常的更新替換，從而導(dǎo)致關(guān)節(jié)退變的啟動(dòng)及發(fā)展［1］。同時(shí)，人們發(fā)現(xiàn)，適宜的應(yīng)力載荷能夠促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖和合成細(xì)胞外基質(zhì)［2，3］，且常常由于體外培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞因培養(yǎng)條件、取材部位不同，以及所受作用力的形式和大小難以精確掌控而導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果存在較大差異［4，5］。所以，我們進(jìn)行了大量的前期研究，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過干預(yù)的同一類軟骨細(xì)胞，其細(xì)胞骨架，粘彈性等力學(xué)參數(shù)均發(fā)生改變［6，7］，故推測(cè)其對(duì)力學(xué)刺激的響應(yīng)能力也應(yīng)存在一定差別，而此類研究尚未見報(bào)道。對(duì)不同年齡及OA軟骨細(xì)胞的力學(xué)生物學(xué)研究，對(duì)于揭示軟骨組織在生長、成熟與退化過程中，軟骨在細(xì)胞分子水平上與力學(xué)環(huán)境的相互作用特點(diǎn)具有一定意義。本研究通過使用新型的Flexercell-4000型力學(xué)加載系統(tǒng)，對(duì)體外培養(yǎng)的不同年齡兔膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞施加更為精確的周期性張應(yīng)變力，觀察特定強(qiáng)度的力學(xué)刺激對(duì)幼年、成年及OA兔軟骨細(xì)胞GAG表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 雄性新西蘭白兔13只，購自山西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。按年齡分為幼年(2月齡)3只作為幼年組，以及成年(5月齡)10只，隨機(jī)分為成年組及OA組，各5只。

1.2 OA模型的制備

1.2.1 手術(shù)方法 OA組:新西蘭白兔采用戊巴比妥鈉(1 ml/kg)肌肉注射麻妥后，雙側(cè)膝關(guān)節(jié)備皮，仰臥固定于實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，消毒、鋪巾。1%利多卡因局麻，取髕骨旁內(nèi)側(cè)切口，逐層切開皮膚及皮下筋膜，打開關(guān)節(jié)腔，將髕骨外翻脫位，極度屈膝下顯露前交叉韌帶，直視下尖刀切斷(輔助檢查前抽屜試驗(yàn)陽性)，注意勿傷及周圍組織。生理鹽水沖洗關(guān)節(jié)腔，絲線縫合關(guān)節(jié)腔及皮膚，無菌敷料包扎固定。術(shù)后每只動(dòng)物給予青霉素40萬U/d，持續(xù)7 d。

成年組:實(shí)驗(yàn)動(dòng)物采用同樣的麻醉方法，打開關(guān)節(jié)腔后，同樣將髕骨脫位，保持關(guān)節(jié)腔暴露時(shí)間大致同實(shí)驗(yàn)組，但不切斷前交叉韌帶，其余處理同上。建立動(dòng)物模型后，置于動(dòng)物飼養(yǎng)籠內(nèi)(1 m×1 m×0.5 m)，可以自由活動(dòng)。

1.2.2 大體觀察及及評(píng)判標(biāo)準(zhǔn) 手術(shù)后20周空氣栓塞處死動(dòng)物，無菌條件下取雙側(cè)膝關(guān)節(jié)標(biāo)本。將左側(cè)膝關(guān)節(jié)用銳刀去除周圍軟組織，保留關(guān)節(jié)軟骨的部分并用咬骨鉗修整成合適的形狀，進(jìn)行軟骨改良Mankin’s評(píng)分［8］。

1.3 膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞分離培養(yǎng) 每次取同一年齡組兔空氣栓塞處死。無菌條件下取雙側(cè)膝關(guān)節(jié)，在超凈工作臺(tái)內(nèi)將膝關(guān)節(jié)打開，銳刀刮取膝關(guān)節(jié)表面軟骨，切成約1 mm3的碎片，無菌D-Hanks液沖洗，棄上清，稱重。按12 ml/g軟骨用0.4%Pronase酶37℃消化90 min，600rpm，5 min。棄上清，按12 ml/g軟骨用無菌0.025%II型膠原酶37℃過夜消化，1200rpm，10 min。棄上清，無菌 D-Hanks液沖洗，100μm 及40 μm細(xì)胞篩網(wǎng)過濾于無菌培養(yǎng)瓶內(nèi)，加入原代軟骨細(xì)胞培養(yǎng)液，臺(tái)盼藍(lán)排除法染色后使用細(xì)胞計(jì)數(shù)板在鏡下觀察細(xì)胞存活率。

1.4 細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù) 依據(jù)下列公式計(jì)算每毫升DMEM中活細(xì)胞數(shù):細(xì)胞總數(shù)=4大格細(xì)胞總數(shù)/4×104×4。細(xì)胞活性率=4大格活細(xì)胞數(shù)/4大格細(xì)胞總數(shù)。

1.5 周期性張應(yīng)變(Cyclic Tensile Strain，CTS)作用于軟骨細(xì)胞:本實(shí)驗(yàn)通過Flexercell-4000型力學(xué)加載系統(tǒng)施加周期性張應(yīng)變于軟骨細(xì)胞。該系統(tǒng)通過一個(gè)真空泵抽吸特制的柔性細(xì)胞培養(yǎng)膜(Bioflex6孔培養(yǎng)板)下方密封的加載底座，形成負(fù)壓而使培養(yǎng)板基底膜產(chǎn)生拉伸應(yīng)變，從而使黏附生長的細(xì)胞受到張力的作用(圖1)。

圖1 Flexercell-4000型力學(xué)加載系統(tǒng)示意圖

細(xì)胞所受力的大小正比于培養(yǎng)膜的牽拉幅度即為應(yīng)變率百分比。加載裝置置于CO2孵育箱內(nèi)，外部由Flexercell-4000配套計(jì)算機(jī)加載程序調(diào)控電機(jī)泵，實(shí)現(xiàn)強(qiáng)度精確控制的力學(xué)加載。

各組細(xì)胞均按照 2 × 104/cm2［9，10］分 別接種于 2 個(gè)BioFlex6孔培養(yǎng)板上，共計(jì)6板，在培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)約60～72 h、當(dāng)軟骨細(xì)胞達(dá)到70% ～80%融合時(shí)，吸去原培養(yǎng)基，加入3 ml無血清培養(yǎng)基，將各個(gè)年齡組的2個(gè)BioFlex六孔培養(yǎng)板分別隨機(jī)分為加載組及空白對(duì)照組，其中加載組板每隔18 h 進(jìn)行 6 h 強(qiáng)度為 sin10% ，0.5Hz 正弦波［9，10，11］的力學(xué)刺激，對(duì)照組置于相同培養(yǎng)箱內(nèi)不做特殊處理。從首次加載時(shí)算起的第24、48和72 h分別留取各年齡組的對(duì)照組及加載組各孔細(xì)胞培養(yǎng)基250 μl(并補(bǔ)充等量新鮮培養(yǎng)基)，分裝于Eppendorf管，-20℃凍存作為標(biāo)本以備檢測(cè)。

1.6 糖胺多糖的檢測(cè) 采用Alcian Blue染色沉淀法測(cè)定［12］。培養(yǎng)液上清由-20℃取出，置于4℃冰箱中解凍。取標(biāo)準(zhǔn)品和樣本各100 μl加入不同的1.5 ml eppendorf離心管中，分別加入8 mol/L鹽酸胍50 μl，搖勻后再分別加入50 μl試劑1，搖勻靜置10 min，各加入650 μl冰凍試劑2過夜。將過夜的溶液在12000 r/min的條件下離心15 min，各取700 μl上清液分別移人新的1.5 ml離心管，各加入500 μlAlcian blue染液，搖勻后靜置至少1 h，然后再在同樣條件下離心15 min，棄去上清液，分別加入750 μlDMSO洗液，震蕩0.5 h，同樣條件下離心15 min，棄去上清液，再分別加入500 μl分?jǐn)?shù)液，震蕩15 min后，在600nm波長下用酶標(biāo)儀測(cè)定糖胺多糖含量。每孔重復(fù)測(cè)量2次取平均值。

2 結(jié)果

2.1 大體標(biāo)本觀察 幼年組的關(guān)節(jié)軟骨表面光滑，色澤乳白，軟骨表面未見無骨贅、裂紋或凹陷，軟骨覆蓋面積大。成年組的關(guān)節(jié)軟骨表面光滑，色澤正常，未見軟骨表面裂紋及凹陷，無骨贅形成。而OA組的關(guān)節(jié)均腫脹變形，軟骨面色澤灰暗，表面粗糙糜爛，軟骨表面裂隙、纖維化主要在滑車及股骨內(nèi)髁，股骨雙髁及脛骨內(nèi)髁關(guān)節(jié)表面軟骨有缺損，軟骨下骨外露，骨贅增生明顯，脛骨內(nèi)側(cè)髁尤顯，軟骨覆蓋面積小。

2.2 糖胺多糖的檢測(cè)結(jié)果(見表1):

表1 加載前后各組細(xì)胞培養(yǎng)基上清液中GAG隨加載時(shí)間變化(μg/ml)，n=6

2.3 數(shù)據(jù)比較結(jié)果 相較于對(duì)照組，CTS加載后各組軟骨細(xì)胞的GAG含量均有顯著升高(P＜0.05)。通過對(duì)CTS作用前后幼年和OA組間;及成年和OA組間GAG含量隨時(shí)間變化趨勢(shì)的統(tǒng)計(jì)分析顯示，兩組均存在明顯差異(P＜0.05)。

與同類細(xì)胞對(duì)照組相比，老年細(xì)胞CTS組GAG升高較在48 h時(shí)最顯著，幼年及成年組則較晚(72 h);且幼年組及成年組細(xì)胞GAG最大升幅較OA組大(P＜0.05)。

3 討論

大量研究表明，適宜的力學(xué)刺激是骨骼正常生長不可缺少的條件之一。力學(xué)刺激強(qiáng)度適當(dāng)與否影響著多種骨與軟骨疾病和損傷的發(fā)生、發(fā)展和修復(fù)的進(jìn)程［13］。關(guān)節(jié)軟骨由少量的軟骨細(xì)胞和大量的細(xì)胞外基質(zhì)組成。基質(zhì)的主要成分是蛋白多糖(Proteoglycan，PG)與膠原蛋白，它是軟骨區(qū)域之間相互聯(lián)系的媒介，是敏感的應(yīng)力傳遞者［14］。GAG占PG相對(duì)分子量90%以上，是其決定性功能基團(tuán)。許多關(guān)節(jié)退變所導(dǎo)致的骨科疾病均與細(xì)胞外基質(zhì)的減少密切相關(guān)。因此，研究力學(xué)刺激對(duì)軟骨細(xì)胞外基質(zhì)合成的作用特點(diǎn)具有重要意義，而此類研究以往尚不多見。

同時(shí)，我們知道不同干預(yù)類型的軟骨細(xì)胞在其形態(tài)、結(jié)構(gòu)以及功能等多個(gè)方面可能具有差異，故而推測(cè)其在相同條件的應(yīng)力作用下所產(chǎn)生的效應(yīng)特點(diǎn)也應(yīng)存在一定差異，我們已進(jìn)行的力學(xué)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)亦證明了這一點(diǎn)［6，15］。因此，本實(shí)驗(yàn)利用新型的Flexercell-4000型力學(xué)加載系統(tǒng)，直接對(duì)離體培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞施加精確的CTS刺激，比較各組細(xì)胞響應(yīng)的差別。本次結(jié)果可以觀察到:各組細(xì)胞在CTS作用后GAG分泌量均有所升高，同時(shí)響應(yīng)特點(diǎn)又存在差異。OA細(xì)胞對(duì)力學(xué)刺激的響應(yīng)能力明顯偏低。

OA細(xì)胞對(duì)力學(xué)反應(yīng)能力的明顯降低，是由于相應(yīng)細(xì)胞器的減少老化，細(xì)胞擴(kuò)增能力減低，或是細(xì)胞基質(zhì)內(nèi)各種細(xì)胞炎性因子含量的變化;還是合并有細(xì)胞骨架重排，細(xì)胞膜通道及信號(hào)傳導(dǎo)、基因表達(dá)調(diào)控方式改變等方面的共同影響?詳細(xì)機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。我們希望通過比較正常及OA軟骨細(xì)胞的力學(xué)生物學(xué)研究，初步認(rèn)識(shí)軟骨細(xì)胞在生長、成熟和退化過程中的自然規(guī)律及相應(yīng)變化，有助于了解軟骨疾病的發(fā)病及修復(fù)特點(diǎn)，同時(shí)也為骨退行性病變的預(yù)防與治療提供一條新途徑。

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