陶寧萍,楊 柳

(上海海洋大學(xué)食品學(xué)院,上海 201306)

頂空固相微萃取氣質(zhì)聯(lián)用測定蒜油揮發(fā)性成分

陶寧萍,楊 柳

(上海海洋大學(xué)食品學(xué)院,上海 201306)

以蒜油揮發(fā)性成分的總峰面積及總峰面積與峰數(shù)的比值為評價指標(biāo),比較了不同萃取頭、吸附溫度、吸附時間及解吸時間對固相微萃取的萃取效率的影響,得到最佳萃取條件：85μm PA萃取頭、吸附溫度 40℃、吸附時間 35min、解吸時間 3min,結(jié)果表明：固相微萃取技術(shù)有效地吸附了蒜油中的揮發(fā)性成分,經(jīng)N IST質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫檢索和文獻(xiàn)對照,共確定 27種成分,并且不需溶劑,分析簡單、快速、經(jīng)濟(jì)。

頂空固相微萃取氣質(zhì)聯(lián)用,揮發(fā)性成分,蒜油,超臨界 CO2萃取

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮大蒜 產(chǎn)地上海,購于上海新蘆苑集貿(mào)市場。

超臨界二氧化碳萃取儀 Spe-ed SFE,美國Applied Separations公司;固相微萃取裝置 手動進(jìn)樣手柄、萃取頭 (100μmPDMS;85μmPA;85μm CAR/PDMS;75μm CAR/PDMS;65μm PDMS/DVB),美國 Supelco公司;氣質(zhì)聯(lián)用儀 Trace MS,美國Agilent質(zhì)譜公司;集熱式恒溫加熱磁力攪拌器DF-101S,鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品的制備 采用超臨界流體萃取技術(shù)(Supercritical Fluid Extraction,SFE)制備蒜油,步驟如下：稱取經(jīng)粉碎的新鮮蒜泥 30.00g,裝入超臨界萃取釜中。在溫度 40℃、壓力 15MPa、靜態(tài)循環(huán) 30min和動態(tài)萃取 90min的條件下進(jìn)行萃取,收集得到淺黃色的蒜油提取物,有濃郁的蒜味。

1.2.2 萃取頭的老化 按照 Supelco公司推薦的條件,將 85μm PA萃取頭于 280℃下老化 1h;100μm PDMS萃取頭于 250℃下老化 0.5h;75μm和 85μm CAR/PDMS萃取頭于 300℃下老化 1h;65μm PDMS/ DVB萃取頭于 250℃下老化 0.5h,老化至無干擾峰出現(xiàn)。

1.2.3 頂空固相微萃取萃取條件的優(yōu)化 取 3mL蒜油提取物,置于含有微型攪拌子的 15mL棕色頂空瓶中。平衡 30min后,調(diào)節(jié)電熱磁力攪拌器溫度至所需溫度,待溫度恒定后,設(shè)定轉(zhuǎn)速 800r/min,將樣品置于磁力攪拌臺上。將 SP ME針管插入頂空瓶的硅橡膠瓶墊,調(diào)整并固定萃取頭頂空體積中的位置,伸出纖維頭。待吸附完畢,縮回纖維頭,抽出針頭。將萃取頭抽出插入 GC-MS聯(lián)用儀,于 250℃解吸,進(jìn)行GC-MS檢測分析。

固相微萃取過程中影響萃取效果的因素有很多,包括萃取頭的種類、吸附溫度、吸附時間和解析時間等。實(shí)驗(yàn)以總峰面積及總峰面積與峰數(shù)的比值作為指標(biāo),來考察各因素對于頂空固相微萃取效果的影響,按表 1所列出的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)。

表1 單因素實(shí)驗(yàn)條件

1.2.4 GC-MS測定 色譜柱：DB-35彈性毛細(xì)管柱(30m×0.25mm ×0.25μm);程序升溫,起始溫度40℃,保持 3min,然后以 10℃/min的升溫速度升溫到 50℃,再以 4℃/min的升溫速度升溫到 120℃,最后以 12℃/min的升溫速度升溫到 240℃,保持 5min;載氣為 He,流量 0.8mL/min;汽化室溫度 250℃。

質(zhì)譜條件：電子轟擊 (EI)離子源;電子能量70eV,燈絲發(fā)射電流為 200μA,離子源溫度為 200℃,接口溫度 250℃,檢測器電壓 350V。

1.2.5 定性定量方法

1.2.5.1 定性 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理由 Xcalibur軟件系統(tǒng)完成。揮發(fā)性成分通過 N IST和W iley譜庫確認(rèn)定性,僅報道匹配度大于 800(最大值為 1000)的鑒定結(jié)果。

1.2.5.2 定量 按峰面積歸一化法計算相對百分含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 萃取頭的選擇

萃取頭是固相微萃取的關(guān)鍵部分。不同的纖維頭涂層種類和厚度對目標(biāo)化合物的吸附萃取能力是不同的,而萃取頭的選擇取決于目標(biāo)化合物的極性、沸點(diǎn)和分配系數(shù)等參數(shù)。實(shí)驗(yàn)中采用 100μm PDMS、 65μm PDMS/DVB、85μm PA以及 75μm和 85μm CAR/PDMS五種不同涂層種類和厚度的纖維頭,在吸附溫度 30℃,吸附時間 30min以及解吸時間 5min下進(jìn)行實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表 2、表 3所示。

不同萃取頭吸附蒜油的揮發(fā)性成分的總離子流圖如圖 1所示,各成分及其峰面積如表 2所示。

圖 1 不同萃取纖維頭吸附揮發(fā)性成分的GC-MS總離子流三維圖

從表 2看出,共 38種成分被檢測出,其中有 16種鏈狀含硫成分,10種環(huán)狀含硫成分及 12種非含硫成分。從表 3看出,五種萃取頭中吸附揮發(fā)性成分?jǐn)?shù)目最多的是 85μm CAR/PDMS,其次是 75μm CAR/PDMS和 65μm PDMS-DVB。但從對蒜油揮發(fā)性成分的總吸附量來說,85μm PA顯示出良好的吸附能力,靈敏度最高,吸附量最大,其次為 65μm PDMS-DVB和 85μm CAR/PDMS。國內(nèi)外研究均表明,大蒜所具有的諸多生物活性功能都?xì)w因于其中的含硫成分。而85μm PA對蒜油中的含硫成分也表現(xiàn)出良好的吸附效果,吸附總量是五種萃取頭中最大的。

此外,本實(shí)驗(yàn)選取了具有相同纖維涂層,但涂層厚度不同的 75、85μm CAR/PDMS。結(jié)果顯示：相較于75μm CAR/PDMS,85μm CAR/PDMS吸附的揮發(fā)性成分的數(shù)目更多且吸附量更大,顯示出對樣品更高的靈敏度。這一結(jié)果也與纖維涂層越厚,固相吸附量越大,靈敏度越高相一致。

綜合考慮對蒜油揮發(fā)性成分的總吸附量及其中重要的含硫成分的總吸附量,故選擇對兩者均有高靈敏度的 85μm PA進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 萃取條件的單因素實(shí)驗(yàn)

圖2 溫度對萃取效率的影響

2.2.1 吸附溫度的影響 從圖 2看出,在 40℃之前,總峰面積隨吸附溫度的升高而增加。但在 40℃之后,總峰面積趨于平穩(wěn)。在 30～35℃時,總峰面積與峰數(shù)的比值有一個輕微的下降過程,在 35～40℃,其數(shù)值又急劇地上升,在 40℃后,慢慢趨于穩(wěn)定。經(jīng)單因素方差分析,發(fā)現(xiàn)吸附溫度 30℃的總峰面積及總峰面積與峰數(shù)比值與 35℃的無顯著差異 (P＞0.05),但與 40℃的存在極顯著差異 (P＜0.01)。而 40℃的總峰面積及總峰面積與峰數(shù)比值與 45～50℃區(qū)間的差異不顯著 (P＞0.05)?？紤]到蒜油中大部分成分不穩(wěn)定,萃取溫度不宜太高。因此,確定 40℃為最佳提取溫度。

表2 不同纖維頭對峰面積的影響

表 3 不同纖維頭對揮發(fā)性成分的影響

2.2.2 吸附時間的影響 從圖3可看出,在吸附時間10～35min時,隨著吸附時間的延長,總峰面積及總峰面積與峰數(shù)比值呈上升趨勢,纖維頭的吸附量明顯增加。經(jīng)過單因素方差分析,在 10～35min時,總峰面積變化極顯著 (P＜0.01),而總峰面積與峰數(shù)比值變化顯著(P＜0.05)。但在 35min后,總峰面積及總峰面積與峰數(shù)比值差異不顯著 (P＞0.05),兩者的數(shù)值均基本趨于穩(wěn)定,說明萃取頭在 35min時已基本吸附飽和。在纖維頭吸附飽和的狀態(tài)下,再增加吸附時間,吸附量增加有限,意義不大,故選擇 35min為最佳吸附時間。

表 4 超臨界萃取蒜油的揮發(fā)性成分的分析結(jié)果

圖3 吸附時間對萃取效率的影響

2.2.3 解吸時間的選擇 從圖 4可看出,在解吸1～2min時,總峰面積及總峰面積與峰數(shù)比值隨著解吸時間的延長而增加,但在 2min后,兩者的數(shù)值均增加緩慢,基本趨于穩(wěn)定。對其進(jìn)行單因素方差分析,發(fā)現(xiàn)解吸時間 1min的總峰面積及總峰面積與峰數(shù)比值與 2min的存在顯著差(P＜0.05)。但 2min的總峰面積及總峰面積與峰數(shù)比值與 3、4、5min區(qū)間的差異不顯著(P＞0.05),且兩者的數(shù)值基本上在吸附 2min后基本保持不變。這說明萃取頭在 250℃下解析 2min便能完全解析所吸附物質(zhì)。為保證萃取頭上的樣品完全解吸掉,不對下次樣品造成污染,且考慮到萃取頭壽命,故確定 3min為最佳解吸時間。

圖4 解吸時間對萃取效率的影響

2.3 超臨界 CO2萃取蒜油揮發(fā)性成分的分析鑒定

選取 85μm PA萃取頭,在吸附溫度 40℃、吸附時間 35min和解吸時間 3min的條件下進(jìn)行超臨界CO2萃取蒜油揮發(fā)性成分的吸附測定,其總離子流圖如圖 5所示。經(jīng) N IST圖庫檢索以及參考文獻(xiàn)[6-8],共檢出 27種成分,各成分及其相對含量如表4所示。

圖5 超臨界萃取蒜油的揮發(fā)性成分的 GC-MS總離子流圖

從表 5中可以看出,超臨界 CO2萃取的蒜油的揮發(fā)性成分主要以一些含硫化合物為主,也含有少量的酯類和醛類化合物。在檢測出的 27種成分中,鏈狀含硫成分有 13種、環(huán)狀含硫成分 9種以及 5種非含硫成分,其中含硫成分總含量高達(dá) 98.91%,而這些含硫成分是大蒜的主要生物活性成分。Block[9]等人發(fā)現(xiàn),二烯丙基二硫醚和三硫醚具有抗血小板凝集活性。Yogeshwer[10]等人研究發(fā)現(xiàn),大蒜中的二烯丙基硫化物能有效抑制癌癥的發(fā)展。

蒜油中的鏈狀含硫成分如二甲基三硫醚(0.50%)、烯丙硫醇 (1.71%)、甲基-1-丙烯基二硫醚(1.15%)、二烯丙基硫醚 (0.51%)、二烯丙基二硫醚(6.57%)和二烯丙基三硫醚(11.42%)等都是大蒜特征性風(fēng)味物質(zhì),具有濃郁大蒜香味。其中對蒜油風(fēng)味有較大貢獻(xiàn)的二烯丙基二硫醚和二烯丙基三硫醚是具有強(qiáng)烈的大蒜香氣的物質(zhì),但沒有催淚作用。此外,環(huán)狀含硫成分中 2,4-二甲基噻吩、二噻烷等都具有大蒜和洋蔥樣的香氣;非含硫成分中 2-丙烯醛(0.5%)具有強(qiáng)烈刺激性,有催淚作用,對風(fēng)味有一定貢獻(xiàn)[11-12]。

Athanasios[13]等認(rèn)為,蒜素?zé)岱纸馍上┍位撬岷土虼┤?后者會進(jìn)一步發(fā)生二聚反應(yīng)形成 3-乙烯基-1,2-二硫雜-4-環(huán)己烯和 3-乙烯基-1,2-二硫雜-5-環(huán)己烯,因此這兩種化合物的含量可作為活性物質(zhì)蒜素含量的指標(biāo)。從表 5中可以看出,使用超臨界 CO2萃取的蒜油中,這兩種成分的含量高達(dá) 58.81%。而周海濱[14]等人利用 GC-MS對超臨界萃取的蒜素進(jìn)行了研究,檢測出兩種成分的含量為 55.48%,說明使用頂空固相微萃取聯(lián)合氣質(zhì)聯(lián)用能有效地分析鑒定超臨界 CO2萃取蒜油的揮發(fā)性成分。

此外,使用固相微萃取氣質(zhì)聯(lián)用法分析超臨界CO2萃取的蒜油,檢測出環(huán)丁烯砜 (1.71%)和癸醛(0.06%)等成分,這一點(diǎn)在其它文獻(xiàn)中未見報道。

3 結(jié)論

3.1 五種萃取頭中吸附揮發(fā)性成分?jǐn)?shù)目最多的是85μm CAR/PDMS,其次是 75μmCAR/PDMS和65μm PDMS-DVB。但從對蒜油揮發(fā)性成分的總吸附量和含硫成分的總吸附量來說,85μm PA顯示出良好的吸附能力,靈敏度最高,吸附量最大。

3.2 實(shí)驗(yàn)確立頂空固相微萃取蒜油揮發(fā)性成分的最佳條件是：吸附溫度40℃,吸附時間 35min,進(jìn)樣口溫度250℃,解析3min。在此萃取條件下,HS-SP ME法可以很好地吸附蒜油樣品的揮發(fā)性風(fēng)味成分,通過GC-MS的分析檢測,可以得到良好的總離子峰圖。

3.3 超臨界萃取蒜油中揮發(fā)性成分主要以揮發(fā)性含硫化合物為主,還含有少量的酯類和醇類化合物(見表 4)。在所測定的 27種成分中,其中鏈狀含硫化合物 13種,環(huán)狀含硫化合物 9種,非含硫化合物 5種,含量分別為 34.54%、64.37%和 1.09%。SP ME技術(shù)結(jié)合 GC-MS對超臨界 CO2萃取蒜油的揮發(fā)性成分有較好的分析效果,且其具有操作方便、不需溶劑、成本低等優(yōu)點(diǎn),具有廣泛的開拓前景。

[1]王錫昌,陳俊卿 .固相微萃取技術(shù)及其應(yīng)用[J].上海水產(chǎn)大學(xué)學(xué)報,2004,13(4)：348-352.

[2]劉源,周光宏 .頂空固相微萃取氣質(zhì)聯(lián)用檢測鴨肉揮發(fā)性風(fēng)味成分[J].江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報,2005,21(2)：131-136.

[3]江健,王錫昌 .頂空固相微萃取與 GC-MS聯(lián)用法分析淡水魚肉氣味成分[J].現(xiàn)代食品科技,2006,22(2)：219-222.

[4]程勁松,王承明 .固相微萃取氣相色譜測定醬油香味成分條件的優(yōu)化[J].食品工業(yè)科技,2008,29(1)：69-71.

[5]左俊,滕建文 .頂空固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)分析芒果的芳香成分[J].食品科技,2008(5)：229-232.

[6]O Calvo-Gómez,J Morales-López.Solid-phase microextraction-gas chromatographic-mass spectrometric analysis of garlicoil obtained by hydrodistillation[J].Journal of ChromatographyA,2004,1036：91-93.

[7]羅蘭,劉佳佳 .不同提取方法的大蒜揮發(fā)油 GC-MS比較分析[J].中成藥,2008,30(1)：139-141.

[8]梁永海,李鳳林 .不同方法萃取大蒜油生產(chǎn)工藝的研究及其成分的分析[J].中國糧油學(xué)報,2004,21(2)：69-71.

[9]Block E ,Ahmad S, et al.Antithrombotic organosulfur compounds from garlic：Structure,mechanistic,and synthetic studies[J].J Am Chem Soc,1986,108：7045-7055.

[10]Yogeshwer Shukla,Neetu Kalra.Cancer chemoprevention with garlic and its constituents[J].Cancer letters,2007,247：167-181.

[11]舒宏福 .新和成食用香料手冊[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社,2004,8：317-337.

[12]孫寶國,劉玉平 .食用香料手冊[M].北京：中國石化出版社,2004,8：400-413.

[13]Athanasios C,Kimbaris,et al.Comparison of distillation and ultrasound-assisted extraction methods for the isolation of sensitive aroma compounds from garlic(Allium sativum)[J]. Ultrasonics Sonochemistry,2006,13：54-60.

[14]周海濱,孫君社 .超臨界 CO2萃取蒜素及其化學(xué)成分研究[J].食品科技,2003(9)：16-18.

Analysis of volatiles from garlic oil by headspace-solid phase m icroextraction-gas chrom atography-m ass spectrom etry

TAO Ning-ping,YANG L iu
(College of Food Science&Technology,ShanghaiOcean University,Shanghai 201306,China)

A m e thod for the de te rm ina tion of vola tiles from ga rlic oil us ing headsp ace solid p hase m ic roextrac tion (HS-SPM E)and gas chrom a tog rap hy-m ass sp ec trom e try(GC/MS)was p resented.By tota l p eak a rea and ra tio of tota lp eak a rea to num be r of p eaks used as the m a in eva lua ting indexes,the ana lys is p a ram e te rs of d iffe rent SPM E fibe rs,extrac tion t im e,extrac tion temp e ra ture,desorp tion t im e we re op t im ized.The op t im um extrac tion cond itions we re ob ta ined as follows：85μm PA fibe r,exp osure for35m in a t40℃,and desorp tion for3m in a t250℃. The results showed tha t SPM E was effec tive to ana lys is of the vola tiles in ga rlic oil,twenty-seven comp ounds we re identified.The m e thod is s imp le,quick,solventless and inexp ens ive.

headsp ace-solid p hase m ic roextrac tion-gas chrom a tog rap hy-m ass sp ec trom e try;vola tile;ga rlic oil; sup e rc ritica lCO2extrac tion

TS207.3

A

1002-0306(2010)03-0172-05

固相微萃取技術(shù) (Solid Phase microextraction, SP ME)是一種新穎的集采樣、萃取、濃縮、進(jìn)樣于一體的萃取濃縮技術(shù),它具有無需有機(jī)溶劑、簡單方便、快速、選擇性好且靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)[1],因而已廣泛用于食品揮發(fā)性風(fēng)味成分的分析檢測,如檢測生熟鴨肉[2]、淡水魚[3]、醬油[4]、芒果[5]等的風(fēng)味成分。大蒜因具有諸多的藥理作用,如抗菌、抗癌、抗氧化、提高機(jī)體免疫力以及降低血糖、血脂和血壓等功能而日益受到人們的關(guān)注,各類大蒜產(chǎn)品也越來越受到消費(fèi)者的青睞。而在眾多的大蒜制品中,又以蒜油為主要形式之一。本工作首次使用頂空固相微萃取聯(lián)合氣質(zhì)聯(lián)用分析超臨界 CO2萃取蒜油的揮發(fā)性成分,通過對萃取頭種類、吸附溫度、吸附時間和解析時間進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn),以確定各因素對萃取效果的影響程度,確立最佳萃取條件。并在該條件下對超臨界 CO2提取蒜油進(jìn)行定性分析,為進(jìn)一步改善蒜油提取工藝和分離純化提供理論基礎(chǔ),對開發(fā)大蒜深加工制品具有現(xiàn)實(shí)意義。

2009-05-21

陶寧萍 (1968-),女,博士,副教授,研究方向：食品營養(yǎng)與安全。