孔繁晟，賁永光，孫愛(ài)群，嚴(yán)春艷（廣東藥學(xué)院藥科學(xué)院，廣州市510006）

超聲法與連續(xù)回流法提取黃芪總黃酮的工藝對(duì)比研究Δ

孔繁晟＊，賁永光，孫愛(ài)群，嚴(yán)春艷#（廣東藥學(xué)院藥科學(xué)院，廣州市510006）

目的：對(duì)比研究超聲法和連續(xù)回流法提取黃芪總黃酮的工藝。方法：以乙醇濃度、提取時(shí)間、固液比、提取溫度為考察因素，黃芪總黃酮提取率為考察指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)優(yōu)選最佳提取工藝條件。結(jié)果：要獲得相同的提取率，超聲法效率更高，其最佳提取工藝為乙醇濃度75%，超聲提取時(shí)間20 min，固液比1∶10，超聲提取溫度25℃，提取率為0.325%。結(jié)論：與連續(xù)回流法比較，采用超聲法提取黃芪總黃酮具有快速、節(jié)省溶劑、提取的有效成分含量高等優(yōu)點(diǎn)。

黃芪；總黃酮；超聲法；連續(xù)回流法；提取工藝

黃芪為豆科植物蒙古黃芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.Var mongholicus（Bge.）Hsiao或膜莢黃芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.的干燥根，為常用中藥，具有補(bǔ)氣固表、利尿托毒、排膿、斂瘡生肌等作用。黃芪所含成分復(fù)雜，但主要可分為三大類(lèi)即黃酮類(lèi)、皂苷類(lèi)和多糖類(lèi)。具有增強(qiáng)免疫系統(tǒng)、抗氧化、延緩衰老、改善功能狀態(tài)、抗病毒、抗癌等功效。黃芪總黃酮有清除O2-·和OH-·防止生物膜過(guò)氧化的作用，也能顯著抑制OH-·對(duì)DNA的損傷作用，是黃芪抗氧化作用的主要成分。黃芪總黃酮對(duì)羥自由基所致V79細(xì)胞的多種損傷皆有不同程度的防護(hù)作用；可降低細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化物的生成，升高細(xì)胞SOD活性，維持細(xì)胞正常代謝。黃酮類(lèi)化合物具有顯著的抗肝臟毒性、抗炎、抗菌及保護(hù)心血管系統(tǒng)的作用[1～3]。筆者以超聲法和連續(xù)回流法提取黃芪總黃酮，以比較2種方法優(yōu)劣，為工業(yè)生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

HH-6型恒溫水浴鍋（江蘇金壇市宏華儀器廠(chǎng)）；RE-52CS型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器、循環(huán)水真空泵（河南省鞏義市英峪予華儀器廠(chǎng)）；UV1101型紫外-可見(jiàn)分光光度儀（上海天美科學(xué)儀器有限公司）；AY120型電子分析天平（日本島津公司）；KH-400KDB型高功率數(shù)控超聲清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）；搖擺式高速中藥粉碎機(jī)（溫嶺市大德中藥機(jī)械有限公司）。

1.2 試藥

黃芪購(gòu)自廣州致信中藥飲片有限公司，由廣東藥學(xué)院中藥學(xué)院藤希峰講師鑒定為真品；蘆丁對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：050923）；乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、冰醋酸、無(wú)水乙酸鈉等試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液的制備

稱(chēng)取3 g黃芪粉末（過(guò)50目篩），在30℃下加95%的乙醇20 mL超聲提取30 min，過(guò)濾，濃縮至干，回收乙醇，浸膏溶于85%的乙醇，定容至25 mL，精密吸取1 mL至25 mL的容量瓶中，30%乙醇定容，得供試品溶液。

2.2 黃芪總黃酮含量的測(cè)定

2.2.1 蘆丁對(duì)照品溶液的制備精確稱(chēng)取蘆丁對(duì)照品10 mg，置于50 mL容量瓶中，加30%的乙醇30 mL，超聲使之溶解，冷卻至室溫，30%乙醇稀釋至刻度，搖勻，得濃度為200 μg· mL-1的蘆丁對(duì)照品溶液，貯藏，備用。

2.2.2 吸收波長(zhǎng)的選擇（1）對(duì)照品測(cè)定波長(zhǎng)的確定：取對(duì)照品溶液1 mL，于400～700 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描，結(jié)果在500 nm波長(zhǎng)處為最大吸收。（2）樣品測(cè)定波長(zhǎng)的確定：取樣品的乙醇提取液1 mL，于400～700 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描，結(jié)果在500 nm波長(zhǎng)處有最大吸收。故確定500 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制備精密吸取蘆丁對(duì)照品溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，分別置25 mL容量瓶中，分別加入5%亞硝酸鈉溶液0.3 mL，搖勻，放置6 min，加入10%硝酸鋁溶液0.3 mL，放置6 min，加入1 mol·L-1氫氧化鈉溶液4 mL，分別用30%的乙醇定容，放置15 min，置比色皿中，在500 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以吸光度（A）為縱坐標(biāo)，濃度（C）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線(xiàn)性回歸，得回歸方程為A＝0.0109C－0.0013（r＝0.9998）。結(jié)果表明，蘆丁對(duì)照品在0～400 μg·mL-1濃度范圍內(nèi)與吸光度線(xiàn)性關(guān)系良好。

2.3 黃芪中總黃酮提取率的測(cè)定

取黃芪提取液，用紫外-分光光度計(jì)于500 nm波長(zhǎng)下測(cè)出吸光度（A），代入回歸方程及下列公式，計(jì)算出黃芪中總黃酮的提取率。提取率（%）＝（C×V×10-6）/W×100%。式中，V為定容體積（mL）；W為黃芪藥粉質(zhì)量（g）；C為黃芪提取液濃度（μg·mL-1）。

2.4 連續(xù)回流提取法

稱(chēng)取黃芪粗粉3 g，加入60倍量70%乙醇，索氏提取1、2、3、4 h，濃縮提取液，回收乙醇，用30%乙醇溶解殘?jiān)⒍ㄈ葜?5 mL，按“2.2.3”項(xiàng)下方法測(cè)定總黃酮含量，繪制單因素圖。提取時(shí)間對(duì)提取率的影響見(jiàn)圖1。

由圖1可知，黃芪總黃酮的提取率隨時(shí)間的延長(zhǎng)而升高，在此工藝條件下提取率不斷上升。提取的傳質(zhì)過(guò)程，需要一段時(shí)間才能達(dá)到平衡，時(shí)間太短，還未達(dá)到平衡，其提取率就偏低；當(dāng)傳質(zhì)過(guò)程達(dá)到平衡后，提取率就不會(huì)明顯上升。

2.5 超聲輔助提取的正交試驗(yàn)

為了考察超聲輔助提取黃芪總黃酮的最佳工藝條件，對(duì)提取時(shí)間（A）、乙醇濃度（B）、固液比（C）、溫度（D）4因素進(jìn)行正交試驗(yàn)。因素水平見(jiàn)表1；正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2；方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。

表1 因素水平Tab 1Factor and level

由表1、表2、表3可知，在影響超聲法提取黃芪總黃酮的4因素中，乙醇濃度對(duì)提取率的影響最大，提取溫度的影響最小。其影響黃芪總黃酮提取率的大小次序先后為：B＞A＞C＞D，即乙醇濃度＞提取時(shí)間＞固液比＞提取溫度。4個(gè)因素中都沒(méi)有顯著性，但是從F值可知，B因素相對(duì)其他因素對(duì)提取率的影響大。因此結(jié)合直觀分析，在本試驗(yàn)參數(shù)的基礎(chǔ)上，為了獲得較高的提取率和節(jié)省溶劑用量，各因素的優(yōu)化工藝參數(shù)為乙醇濃度75%，超聲提取時(shí)間20 min，固液比1∶10，超聲提取溫度25℃。經(jīng)測(cè)定，在此最優(yōu)工藝條件下，黃芪中總黃酮的提取率是0.325%。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Tab 2Results of orthogonal experiment

表3 方差分析結(jié)果Tab 3Results of variance analysis

2.6 超聲法與連續(xù)回流法提取效果對(duì)比

在不同提取方法下黃芪總黃酮的提取率見(jiàn)表4。

表4 在不同提取方法下黃芪總黃酮的提取率Tab 4Extraction rate of total flavonoids from RadixAstragali by different extraction technologies

由表4可知，相比連續(xù)回流法，超聲法在提取率增加22.6%的情況下，提取時(shí)間縮短為原來(lái)的1/12，固液比為原來(lái)的2/3。因而超聲法具有節(jié)省溶劑用量、省時(shí)、高效、有效成分提取率高等優(yōu)點(diǎn)。

3 討論

黃芪為常用中藥材，在我國(guó)分布廣泛。傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為黃芪具有補(bǔ)氣固表、利尿托毒、排膿、斂瘡生肌等功能。隨著近代藥理研究的深入，特別是增強(qiáng)免疫系統(tǒng)、抗氧化、延緩衰老、改善功能狀態(tài)、抗病毒、抗癌等功能的發(fā)現(xiàn)，黃芪的應(yīng)用將越來(lái)越廣泛。黃芪總黃酮的有效提取及含量測(cè)定，是了解其藥理作用和合理開(kāi)發(fā)的重要基礎(chǔ)工作。但是，由于不同產(chǎn)地、不同藥用部位所含的有效成分含量差異較大，所以在中藥制劑生產(chǎn)過(guò)程中要注意控制原料藥材的質(zhì)量。另外，應(yīng)注意各種方法的綜合使用，為更好地開(kāi)發(fā)利用黃芪資源奠定基礎(chǔ)。

超聲波是頻率大于20 Hz以上、人的聽(tīng)覺(jué)閾以外的聲波，具有頻率高、波長(zhǎng)短、功率大、穿透力強(qiáng)的特點(diǎn)。超聲提取法是利用超聲波具有的機(jī)械效應(yīng)、空化效應(yīng)及熱效應(yīng)，通過(guò)增大介質(zhì)分子的運(yùn)動(dòng)速度、增強(qiáng)介質(zhì)的穿透力以提高中藥有效成分提取效率的方法。近年來(lái)，超聲技術(shù)已廣泛應(yīng)用于生物堿、黃酮類(lèi)、多糖、皂苷、有機(jī)酸、蛋白質(zhì)、油脂等物質(zhì)的提取，應(yīng)用研究表明超聲提取法具有能耗低、效率高、不破壞有效成分的特點(diǎn)，有較高的開(kāi)發(fā)價(jià)值。因此，用它強(qiáng)化天然產(chǎn)物的提取已成為當(dāng)前研究的一個(gè)熱點(diǎn)[4～7]。本文采用超聲法提取黃芪中的總黃酮，并與連續(xù)回流提取法作比較，通過(guò)進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)超聲法提取黃芪總黃酮的提取率比連續(xù)回流法高；超聲法具有節(jié)省溶劑用量、省時(shí)、高效、有效成分提取率高等優(yōu)點(diǎn)。通過(guò)采用正交設(shè)計(jì)法確定超聲提取的最佳工藝條件，可為黃芪的工業(yè)應(yīng)用提供工藝參數(shù)。

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Comparison of Ultrasonic Method and Continuous Reflux Extraction Process of Total Flavonoids from Radix Astragali

KONG Fan-sheng，BI Yong-guang，SUN Ai-qun，YAN Chun-yan（College of Pharmacy，Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510006，China）

OBJECTIVE：To compare the ultrasound method and continuous reflux extraction process of total flavonoids from Radix Astragali.METHODS：The extraction technology was optimized by orthogonal test with the content of total flavonoids of Radix Astragali as index and with the concentration of ethanol，extraction time，solid-fluid ratio，extraction temperature as factors. RESULTS：Ultrasound extraction process was superior to continuous reflux extraction process.Optimal extraction technology was as follows：the concentration of ethanol of 75%，ultrasonic extraction time of 20 min，solid-liquid ratio of 1∶10，ultrasonic extraction temperature of 25℃and extraction rate of 0.325%.CONCLUSION：As compared with continuous reflux extraction process，ultrasonic extraction is fast to operate，solvent saving and high extraction.

Radix Astragali；Flavonoids；Ultrasonic method；Continuous reflux extraction；Extraction technology

R283；R97

A

1001-0408（2010）19-1752-03

2009-12-04

2010-03-07）

Δ廣東省中醫(yī)藥局項(xiàng)目（2009418）；廣東藥學(xué)院師資隊(duì)伍建設(shè)經(jīng)費(fèi)資助項(xiàng)目

＊實(shí)驗(yàn)師，主管藥師。研究方向：藥物制劑、制藥工程。電話(huà)：020-39661095。E-mail：kmkfs@163.com

#通訊作者：副教授，博士。研究方向：天然藥物化學(xué)。E-mail：ycybridge@163.com