雙歧桿菌耐氧性研究及其應(yīng)用*

趙建云，左芳雷，肖滿，陳尚武

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)營養(yǎng)工程學(xué)院，教育部北京市功能乳品重點實驗室，北京，100083)

雙歧桿菌耐氧性研究及其應(yīng)用*

趙建云，左芳雷，肖滿，陳尚武

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)營養(yǎng)工程學(xué)院，教育部北京市功能乳品重點實驗室，北京，100083)

雙歧桿菌是存在于人和某些動物腸道中的功能益生菌，與機體的健康狀況密切相關(guān)。由于其獨特的生理功能優(yōu)勢，已經(jīng)成為微生物學(xué)及臨床醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的研究熱點之一。但雙歧桿菌內(nèi)部缺少有效的活性氧清除系統(tǒng)，對氧氣十分敏感，限制了雙歧桿菌的研究范圍與實踐應(yīng)用。如何提高雙歧桿菌的耐氧性能成為未來研究的重點。從雙歧桿菌耐氧性及其耐氧機制、改善其耐氧性方法及耐氧雙歧桿菌制品的應(yīng)用前景等方面進(jìn)行探討，為今后雙歧桿菌的應(yīng)激理論研究及實際應(yīng)用提供參考。

雙歧桿菌，耐氧性，耐氧機制，氧化應(yīng)激

雙歧桿菌(Bifidobacterium)是人和動物腸道內(nèi)數(shù)量最多、功能最重要的革蘭氏陽性無芽胞菌。在長期進(jìn)化過程中與宿主形成了和諧的依存關(guān)系，和其他厭氧菌一起定植于腸黏膜上皮細(xì)胞表面，形成一個生物學(xué)屏障，阻止致病菌的侵入［1］，對維持腸道的微生態(tài)平衡起著重要作用。雙歧桿菌在體內(nèi)具有預(yù)防和治療腹瀉、減輕便秘和乳糖不耐性癥狀、提高機體免疫力、抑制腫瘤發(fā)生、減少膽固醇等多方面作用［2］，應(yīng)用領(lǐng)域十分廣泛。

腸道內(nèi)益生菌需要保持很高的活菌數(shù)才能發(fā)揮其生理功能，要達(dá)到治療效果，每天至少攝入108CFU［3］，這就要求含有益生菌的食品生產(chǎn)和儲存過程中，大量的益生菌必須保存下來。由于雙歧桿菌在氧氣和酸度較低的條件下，生長緩慢且容易死亡，對營養(yǎng)要求比較嚴(yán)格，造成培養(yǎng)的難度大，限制了其在食品中的應(yīng)用。

為了擴大雙歧桿菌研究與應(yīng)用范圍，雙歧桿菌適應(yīng)環(huán)境脅迫的研究逐漸增多，研究者分別從不同角度闡釋雙歧桿菌適應(yīng)環(huán)境機制及菌體內(nèi)自身的調(diào)節(jié)變化，但對于雙歧桿菌耐氧性的研究還不是很深入，僅限于對氧脅迫引起的細(xì)胞水平的研究，對于分子方面的研究還很欠缺，而雙歧桿菌的氧敏感性是一個普遍的、迫切需要解決的問題。本文就雙歧桿菌耐氧性、耐氧機制、改善其耐氧性方法及耐氧雙歧桿菌制品的應(yīng)用前景等方面做一介紹，以期為今后雙歧桿菌的氧化應(yīng)激理論研究和實踐提供參考。

1 雙歧桿菌的耐氧性

雙歧桿菌屬于放線菌科革蘭氏陽性菌，GC含量高、專性厭氧，過氧化氫酶陰性。有氧存在時，雙歧桿菌會形成H2O2、O2－、HO·等活性氧［4］。HO·氧化活力最高，O－2次之，H2O2的氧化活力最弱。雖然H2O2是弱氧化劑，但過渡金屬會使其轉(zhuǎn)變成氧化活力高的HO·［5］?；钚匝踹€能夠擴散到細(xì)胞內(nèi)，氧化并破壞細(xì)胞內(nèi)的重要物質(zhì)，如細(xì)胞膜脂質(zhì)、酶和DNA，造成代謝障礙。

菌株不同，雙歧桿菌對氧氣的耐受性也不同。有關(guān)雙歧桿菌耐氧性的研究較早的是1969年的de Vries［6］，通過檢測20種雙歧桿菌對氧氣的敏感度，依據(jù)菌種在有氧環(huán)境下對氧氣的耐受性和過氧化氫合成情況，將雙歧桿菌分為了對氧氣不太敏感、比較敏感、極度敏感的3類菌株。隨后有關(guān)雙歧桿菌對氧氣敏感度的研究逐漸增多。Kawasaki［4］發(fā)現(xiàn)B.boum JCM 1211T和 B.thermophilum JCM 1207T能夠在含20%氧氣的環(huán)境下生長。Li Qingqing［7］分離鑒定了1株耐氧的雙歧桿菌Bifidobacterium animalis subsp.lactis Qq08，比已商業(yè)化的菌株Bifidobacterium lactis Bb12更具有優(yōu)良性能。

2 雙歧桿菌的耐氧機制

正常情況下，生物機體擁有完整的氧化-抗氧化平衡機制，但當(dāng)機體受外界環(huán)境毒害影響較大時，機體產(chǎn)生的活性氧及其他自由基不能有效地被抗氧化機制所清除，就會對機體產(chǎn)生毒害作用。

在特定環(huán)境下，H2O2、O2－等活性氧濃度超過細(xì)胞的清除能力時，會產(chǎn)生氧化應(yīng)激。在應(yīng)激條件下，細(xì)菌形成信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)來感知周圍環(huán)境的變化，并且控制與細(xì)胞防御機制有關(guān)基因的協(xié)同表達(dá)［8］?；虻谋磉_(dá)通過轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控來實現(xiàn)，形成的防御系統(tǒng)有助于微生物在應(yīng)激條件下的存活。

在環(huán)境氧氣或者其他氧化物存在時，雙歧桿菌會通過自身內(nèi)部的調(diào)節(jié)進(jìn)行氧化適應(yīng)，盡可能滿足自身生長的需求?？傮w來講，其氧化應(yīng)激途徑主要有以下幾種。

2.1 螯合金屬離子

有氧存在時，雙歧桿菌會形成H2O2、、HO·等活性氧。而超氧陰離子()和H2O2通過以下反應(yīng)形成活性更高的羥基自由基HO·。

通過螯合金屬離子，可以有效防止高活性氧的生成，減少不良氧化反應(yīng)的進(jìn)行。Meei-Yn等證實長雙歧桿菌B6和15708具有較好的金屬離子螯合能力，其中長雙歧桿菌15708在試驗菌株中具有最高的銅離子螯合能力［5］。研究表明雙歧桿菌對多種自由基，如脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物等都有清除作用［9］。

2.2 抗氧化酶類

2.2.1 NADH氧化酶和NADH過氧化物酶

益生菌中的抗氧化酶如超氧化物歧化酶(SOD)、含錳假性過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶以及硫氧還蛋白還原酶、阿魏酸酯酶和巰基化合物等具有清除活性氧和自由基的作用。

雙歧桿菌細(xì)胞內(nèi)缺乏過氧化氫酶(CAT)活性，氧氣的清除是由NADH氧化酶和NADH過氧化物酶決定的。Shimamura等［10］發(fā)現(xiàn)菌株的耐氧性與NADH氧化酶和NADH過氧化物酶活力呈正相關(guān)。Shin等［11］也認(rèn)為大多數(shù)氧敏感雙歧桿菌的NADH氧化酶和NADH過氧化物酶活力低，而大多數(shù)耐氧雙歧桿菌的這兩種酶活力高。Talwalkar等［12］研究表明，不同的氧氣濃度促使雙歧桿菌的NADH氧化酶活力提高1.5～3倍，NADH過氧化物酶活力提高1.5～2倍，可能是由于氧氣誘導(dǎo)產(chǎn)生更多的NADH氧化酶和NADH過氧化物酶，以便抵制氧的毒性作用。還有研究顯示NADH氧化酶和NADH過氧化物酶活力不是造成它們耐氧性差異的主要原因，酶的類型也影響雙歧桿菌的耐氧性［4］。

這兩種酶可能通過以下途徑［13］將O2轉(zhuǎn)化成無毒性的H2O，進(jìn)而提高雙歧桿菌的耐氧性。

2.2.2 超氧化物歧化酶(SOD)和其他酶

SOD是金屬蛋白酶，通常在好氧菌和兼性厭氧菌中有Mn-SOD或Fe-SOD，在厭氧菌中有Fe-SOD，而Cu-SOD和Zn-SOD存在于真核細(xì)胞中［14］。

耐氧型和厭氧型雙歧桿菌都具有SOD活性，但活力很低，并且彼此之間沒有差異。雖然雙歧桿菌具有SOD，但酶活力不因氧氣誘導(dǎo)而增加，可見SOD不是雙歧桿菌耐氧機制的關(guān)鍵因素［12］，但SOD可以通過以下途徑將O2轉(zhuǎn)化成H2O:首先通過反應(yīng)將O2轉(zhuǎn)化成，而后通過反應(yīng)將轉(zhuǎn)化成H2O2，最后將H2O2轉(zhuǎn)化成H2O。

雙歧桿菌的耐氧機制還可能涉及一些其他酶類。Schell等［15］對 B.longum NCC2705 的基因組序列進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)了3種可能與雙歧桿菌耐氧性有關(guān)的酶基因:巰基過氧化物酶基因、烷基過氧化物酶基因(ahpC)和肽蛋氨酸亞砜還原酶基因，這些酶能夠抵制活性氧對蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的氧化破壞。

2.3 其他途徑

雙歧桿菌細(xì)胞中存在著非酶的防御機制，充分利用其中的還原性成分來適應(yīng)生長中氧含量變化。如雙歧桿菌代謝產(chǎn)物(胞外多糖、脂磷壁酸)和巰基化合物等具有抗氧化活性。

環(huán)丙烷脂肪酸(CFA)是多數(shù)細(xì)菌細(xì)胞膜磷脂的重要組成部分，CFA與細(xì)菌的低溫耐受力、酸耐受力、醇耐受力以及氧耐受力都有關(guān)系。Shin等［16］用GC-MASS分析雙歧桿菌的脂肪酸組成后，表明雙歧桿菌的CFA主要成分是9，10-亞甲基十八碳酸，耐氧長雙歧桿菌含有該化合物，而氧敏感的青春雙歧桿菌卻不含有此物質(zhì)。Ahn等［17］進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，耐氧長雙歧桿菌通過顯著地增加9，10-亞甲基十八碳酸的含量來抵御環(huán)境中的氧脅迫。

3 改善雙歧桿菌耐氧性的方法

為了避免雙歧桿菌在益生菌制品的加工、包裝、貯藏和攝入機體過程中大量失活，人們提出了很多解決雙歧桿菌氧中毒的方法。

3.1 雙歧桿菌的耐氧馴化

雙歧桿菌要求在嚴(yán)格的厭氧環(huán)境下生長，這種特性不僅給試驗和生產(chǎn)帶來諸多不便，也給食品生產(chǎn)、運輸和存儲帶來了很大困難。在食品和微生態(tài)制劑中應(yīng)用最廣且最具發(fā)展?jié)摿Φ氖悄脱蹼p歧桿菌。

將微生物暴露于亞致死劑量的應(yīng)激或逐漸增加應(yīng)激劑量能夠使細(xì)胞產(chǎn)生適應(yīng)反應(yīng)，進(jìn)而更好地抵制致死劑量的應(yīng)激。部分雙歧桿菌具有一定的耐氧力，較易進(jìn)行耐氧馴化。馴育過程中，由于接觸氧而誘導(dǎo)雙歧桿菌產(chǎn)生誘導(dǎo)酶H2O2酶，能夠解除對雙歧桿菌的毒害作用，通過馴育厭氧就可獲得耐氧菌株。

國內(nèi)外有大量進(jìn)行雙歧桿菌耐氧馴化的研究，使用不同基質(zhì)進(jìn)行的雙歧桿菌耐氧馴化都有涉及。Talwalkar［18］第一次進(jìn)行了雙歧桿菌對氧氣敏感度的定量檢測，使用了一種相對細(xì)菌生長率(RBGR)方法，RBGR是需氧生長和厭氧生長的比率，提供了一個數(shù)值上的指標(biāo)。Talwalkar和 Kailasapathy［19］使用酸奶作為基質(zhì)，通過泵入純氧，來逐漸增加基質(zhì)中溶氧量，進(jìn)而逐級適應(yīng)雙歧桿菌，最終獲得的適應(yīng)細(xì)胞能夠抵制高濃度溶解氧破壞作用，其在溶氧量為210mL/L的酸奶中貯存35 d，活菌數(shù)仍沒有降低。

氧適應(yīng)能夠提高雙歧桿菌的的耐氧性，進(jìn)而避免其在益生菌制品的加工、包裝、貯藏和攝入過程中失活。該方法廉價、經(jīng)濟，是一種很有發(fā)展前景的方法。

3.2 抗氧化劑進(jìn)行去氧脅迫

利用抗氧化劑來消除培養(yǎng)基中的氧氣，可以解除氧氣對于代謝過程的抑制作用。糖酵解過程中，果糖-6-磷酸解酮酶(F6PPK)為一個重要的限速酶，由于氧氣可以經(jīng)過氧化氫氧化酶的作用轉(zhuǎn)變成H2O2，培養(yǎng)基中氧含量的增加導(dǎo)致H2O2逐漸積累，菌體自身不能解毒，對F6PPK產(chǎn)生毒害作用，抑制了F6PPK發(fā)揮作用，最終導(dǎo)致代謝過程中糖酵解作用被抑制，以至于影響了雙歧桿菌的生長［20］。

氧化還原電位對雙歧桿菌的生存有明顯影響。當(dāng)雙歧桿菌生長的環(huán)境中存在分子氧時，會提高環(huán)境的氧化還原電位，從而毒害菌體。如果發(fā)酵液中存在還原性物質(zhì)，可以使發(fā)酵液保持較低的氧化還原電位，或與氧發(fā)生化學(xué)反應(yīng)消耗發(fā)酵液中殘留的氧，有利于專性厭氧微生物繁殖，從而增加雙歧桿菌制品中的活菌數(shù)。Zhao［21］選用動物雙歧桿菌和嬰兒雙歧桿菌，通過在脫脂乳培養(yǎng)基中加入抗壞血酸鈉、半胱氨酸等，雙歧桿菌的活菌數(shù)增加了150%～190%，該方法可簡單而有效地高密度培養(yǎng)雙歧桿菌。

3.3 制作微膠囊

微膠囊化的雙歧桿菌可以抵抗高濃度的氧氣，保證制劑在生產(chǎn)和貯藏過程中的高活菌數(shù);并在通過胃、腸環(huán)境時獲得一定的抵御胃酸、膽汁、消化酶的能力［22］，最后能以很高的活菌數(shù)定植于腸黏膜上。

制作微膠囊的過程是一個將細(xì)胞放在膠囊膜內(nèi)部免受損傷和細(xì)胞死亡的過程［23］，這種膠囊基質(zhì)對細(xì)胞的封裝能夠?qū)⒓?xì)胞與有害因子(如O2)直接分離開，同時還能允許營養(yǎng)物質(zhì)溶液進(jìn)出基質(zhì)，保持合適水分活度，最終使活菌含量增加，提高和延長雙歧桿菌和活菌的保存期、改變雙歧桿菌劑產(chǎn)品的形態(tài)、提高產(chǎn)品的穩(wěn)定性，以此發(fā)揮其生理保健功能。

3.4 雙歧桿菌厭氧特性的基因調(diào)控

從遺傳和生化角度看，厭氧菌或兼性厭氧菌SOD基因活性很小，只在有氧的環(huán)境下，通過誘導(dǎo)作用，SOD酶活性才顯示出來。若通過生物工程手段改變超氧化物歧化酶的調(diào)控基因則可能提高雙歧桿菌耐氧活性。而且將外源的SOD基因和CAT基因轉(zhuǎn)入?yún)捬蹙?，還能提高厭氧菌對氧的抵抗能力。

質(zhì)粒能夠編碼各種重要的特殊性質(zhì)，并且已經(jīng)成為雙歧桿菌遺傳學(xué)研究及基因工程菌株構(gòu)建的重要部分，含有質(zhì)粒載體的雙歧桿菌能夠獲得質(zhì)粒編碼的許多自身沒有的性狀。目前構(gòu)建的雙歧桿菌載體以大腸桿菌－雙歧桿菌穿梭質(zhì)粒為主，選擇載體后，在其基礎(chǔ)上插入雙歧桿菌功能性基因、復(fù)制子基因、選擇性標(biāo)記(食品級標(biāo)記)等片段，構(gòu)建出克隆載體和表達(dá)載體［24］。

根據(jù)上述雙歧桿菌厭氧機理及基因工程手段，可以對雙歧桿菌的厭氧特性進(jìn)行改造，提高其對氧的耐受性，從而顯著改善雙歧桿菌在食品中的存活率和穩(wěn)定性。大致路線為:篩選食品級雙歧桿菌，提取質(zhì)粒、構(gòu)建表達(dá)載體，將克隆到的CAT和SOD等耐氧有關(guān)的基因與載體連接，轉(zhuǎn)化到雙歧桿菌使其表達(dá)?；蚬こ屉p歧桿菌以其獨特的功能特性在食品工業(yè)、醫(yī)藥行業(yè)中能夠獲得廣泛的應(yīng)用。

此外，還可以借鑒其他厭氧菌內(nèi)部的抵抗氧化應(yīng)激的機制。通過基因工程的方法改造雙歧桿菌，使雙歧桿菌內(nèi)部形成一個降解氧氣的網(wǎng)絡(luò)，這對改善其耐氧性有重要意義。嚴(yán)格厭氧細(xì)菌丙酮丁酸梭菌的氧化應(yīng)激反應(yīng)中非血紅素蛋白 (revRbr)的表達(dá)量上調(diào)，其中的NROR(NADH:紅素氧還蛋白氧化還原酶)、Rd(紅素氧還蛋白)也都與抗氧化應(yīng)激有關(guān)［25］。厭氧菌脫硫弧菌有很好的氧氣代謝途徑［26］(圖1)。

3.5 其他改善方法

圖1 脫硫弧菌降解氧氣的途徑

呂兵利用原生質(zhì)體融合技術(shù)將專性厭氧的短雙歧桿菌和啤酒酵母進(jìn)行原生質(zhì)體細(xì)胞融合，成功初篩出兼具兩親本生物學(xué)性狀、較穩(wěn)定的融合子BSFI和BSF2，改善了雙歧桿菌的耐氧性。

對于雙歧桿菌制品(如酸奶)，可利用高耗氧的菌株來解除基質(zhì)中氧氣對于雙歧桿菌的抑制作用［27］。嗜酸乳桿菌的代謝活動要依靠氧氣來進(jìn)行，通過嗜酸乳桿菌來清除酸奶中溶解氧，從而幫助雙歧桿菌來生長。

利用低氧滲透性包裝材料是很重要的方法，通常用的聚乙烯和聚苯乙烯都對氧氣有一定滲透，阻止氧氣滲透的包裝材料能夠增加包裝內(nèi)雙歧桿菌的活菌數(shù)。Miller等［28］提出了一種相對便宜而且不滲透氧氣的包裝材料，在聚苯乙烯基礎(chǔ)上加一層隔絕氣體的NupakTM，儲存過程中該包裝材料的內(nèi)部溶氧量沒有增加。

4 雙歧桿菌制品的應(yīng)用前景

雙歧桿菌制品是利用宿主自身的優(yōu)勢生理細(xì)菌——雙歧桿菌作發(fā)酵劑，通過工業(yè)化發(fā)酵擴大生產(chǎn)制成活菌制劑，再回歸宿主原來的生境，達(dá)到調(diào)節(jié)或維持機體正常生理狀態(tài)的制品。

目前市場上有關(guān)雙歧桿菌的商品根據(jù)其機能可分為雙歧桿菌食品、含有雙歧桿菌及其生長促進(jìn)物質(zhì)的特定保健性食品和雙歧桿菌藥品。

通過了解雙歧桿菌的耐氧機制及研究雙歧桿菌的耐氧能力、利用各種手段改善雙歧桿菌的耐氧性能夠擴大雙歧桿菌的研究應(yīng)用范圍。未來的研究將集中在如何通過各種手段鍛煉菌體，使其適應(yīng)在工藝操作中不利于生存的理化環(huán)境下保持存活的數(shù)量和質(zhì)量;如何提供足量的活菌以便充分發(fā)揮其生理功能等方面。

選擇一個好的益生菌的標(biāo)準(zhǔn)之一是貨架期的耐受性和穩(wěn)定性。逐步增加氧氣的濃度能夠使細(xì)胞逐漸適應(yīng)高氧氣脅迫，同時注意菌種的氧化研究對于食品系統(tǒng)的實踐。選育耐氧性能良好的菌株，或者利用基因工程手段得到高耐氧的菌株，可以大大擴展雙歧桿菌的使用范圍。如與其他乳酸菌聯(lián)菌株發(fā)酵產(chǎn)品;配合一些雙歧因子能夠生產(chǎn)出具有多種功效的制品;除用于食品醫(yī)藥外，雙歧桿菌還可應(yīng)用于畜牧業(yè);雙歧桿菌是一種廣泛分布于溫血動物腸道的有益菌，可利用該類菌來促進(jìn)畜禽的健康生長和延長蜜蜂的壽命;含有高活菌數(shù)酸奶的生產(chǎn)等。

5 展望

雙歧桿菌的生存及氧氣毒害是“古老”又“新穎”的話題，如何能夠更好地運輸含有活菌數(shù)高的產(chǎn)品及獲得更長的貨架期還是至關(guān)重要的。目前對于雙歧桿菌耐氧性的研究大多數(shù)是關(guān)于氧引起的細(xì)胞水平的研究，從分子水平去闡明氧氣引起的變化以及在氧脅迫時的脅迫蛋白的研究還是較少。有關(guān)氧氣與雙歧桿菌的相互作用的研究比較欠缺，氧氣對雙歧桿菌毒害作用的機制不太透徹，不能在操作上給出實際的指導(dǎo)意義。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)某些氧脅迫引起了蛋白質(zhì)變化，從這個方向去研究也許能夠為雙歧桿菌的生化代謝途徑和促進(jìn)氧應(yīng)激適應(yīng)有很大的幫助。如何通過分子手段篩選和重組成新的具有高耐氧性的雙歧桿菌成為其在工業(yè)化生產(chǎn)中應(yīng)用的關(guān)鍵。

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Research and Application on the Oxygen Tolerance of Bifidobacteria

Zhao Jian-yun，Zuo Fang-lei，Xiao Man，Chen Shang-wu
(Laboratory of Function Dairy Ministry of Education and Beijing City College of Food Science and Nutritional Engineering，China Agricultural University，Beijing 100083，China)

Bifidobacteria are functional Probiotics，which are commonly useful to the health of organisms.Bifidobacteria have been studied widely in microbial realm，food field and medical community due to their unique functions.Bifidobactria are oxygen-sensitive bacteria，they can’t convert reactive oxygen into nontoxic molecules，thus their research and application are restricted.In the future，the oxygen tolerance of Bifidobacteria will become more and more important.The oxygen tolerance and its mechanism，the methods to improve oxygen tolerance，the prospect of the Bifidobacteria products with high oxygen tolerance were reviewed in this paper aimed to provide references for future research.

Bifidobacteria，Oxygen tolerance，Oxygen mechanism，Oxidation stress

碩士研究生。

*國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃(863)支持項目(項目編號:2008AA10Z310)國家自然科學(xué)基金(項目編號:31071507)

2010－08－16，改回日期:2010－09－13