阿司匹林對高脂高糖誘發(fā)的大鼠脂肪性肝炎的治療作用

沈 洪，亓志剛，謝梅林

(1.湖州師范學(xué)院醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，浙江湖州 313000;2.蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部藥理學(xué)系，江蘇蘇州 215123)

非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis，NASH)是一種非酒精性脂肪性肝?。?-2］，其發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚。目前較公認(rèn)的“二次打擊”學(xué)說認(rèn)為，胰島素抵抗(insulin resistance，IR)是第一次打擊，可導(dǎo)致肝臟對多種損傷因素的敏感性增加;第二次打擊如氧化應(yīng)激和炎性細(xì)胞因子等損傷因子可導(dǎo)致脂肪變的肝臟發(fā)生炎癥、壞死和隨后的纖維化［3］。近年越來越多的研究資料顯示，過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome peroliferator-activated receptor，PPAR)在脂肪性肝炎的發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)歸過程中發(fā)揮了重要的作用［4-5］，故目前在臨床上常將PPARα激動劑和(或)PPARγ激動劑用于脂肪性肝炎的治療，但治療效果不盡相同，而且有些PPARα激動劑和PPARγ激動劑具有明顯的不良反應(yīng)。從理論上推測，應(yīng)用PPARα/γ雙重激動劑的治療效果應(yīng)更好，因?yàn)閮烧呖僧a(chǎn)生協(xié)同的抗炎作用。

阿司匹林為一種傳統(tǒng)的解熱、鎮(zhèn)痛和抗炎藥物，可通過抑制環(huán)氧合酶(cyclooxygenase，COX)的活性減少前列腺素(prostaglandin，PG)的合成來發(fā)揮治療作用。近年來有文獻(xiàn)報道，阿司匹林可以通過激活 PPARα/γ 發(fā)揮其藥理學(xué)活性［6］，而且阿司匹林可以影響大鼠肝臟和腎臟中PPARα/γ相關(guān)靶基因的表達(dá)［7］，提示阿司匹林可能是 PPARα/γ 雙重激動劑，但未見阿司匹林用于脂肪性肝炎治療的研究報道。本研究制備高脂高糖誘發(fā)的大鼠脂肪性肝炎模型，觀察阿司匹林對脂肪性肝炎的治療作用。

1 材料與方法

1.1 動物

SD大鼠，雄性，清潔級，體重為220～240 g，由蘇州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(蘇):2007-0010;動物使用許可證號:SYXK(蘇):2007-0035。大鼠飼養(yǎng)于溫度為19～23℃，相對濕度為50% ～70%的屏蔽區(qū)內(nèi)，自由飲水進(jìn)食。實(shí)驗(yàn)前大鼠適應(yīng)環(huán)境3 d。動物實(shí)驗(yàn)依照蘇州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物應(yīng)用及管理?xiàng)l例規(guī)定進(jìn)行。

1.2 藥物、試劑和儀器

阿司匹林，白色粉末，購自美國Sigma公司，批號:105K0131。臨用時用蒸餾水配成0.5%的濃度?？偰懝檀?total cholesterol，TC)和甘油三酯(triglyceride，TG)測定試劑盒購自浙江伊利康生物技術(shù)有限公司，批號均為090903。血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(glutamic pyruvic transaminase，GPT)和空腹血糖(fasting blood glucose，F(xiàn)BG)測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所，批號均為20081222。大鼠基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)ELISA測定試劑盒購自上海西唐生物科技有限公司，批號:0911271。

722型分光光度計，由上海第三分析儀器廠生產(chǎn);80-2型臺式離心機(jī)，由上海醫(yī)療器械有限公司手術(shù)器械廠生產(chǎn);TCL-10G型高速臺式離心機(jī)，由上海安亭科學(xué)儀器廠生產(chǎn);FJ-200型高速分散均質(zhì)機(jī)，由上海金達(dá)生化儀器有限公司生產(chǎn);MR23i臺式冷凍離心機(jī)，由法國Jouan公司生產(chǎn);AL104電子天平，由梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司生產(chǎn)。

1.3 脂肪性肝炎模型的制備及分組

大鼠分為正常對照組和高脂高糖造模組。造模組大鼠于每天上午9:00 ig給予高脂高糖乳劑(由10%膽固醇，40%玉米油，15%蔗糖，2%蛋白質(zhì)，1%膽鹽，3.1%丙二醇，3.6%吐溫-80 等組成［8］)10 ml·kg-1，每天1次，正常對照組給予等體積蒸餾水。6周后處死3只大鼠觀察肝臟脂肪變性及炎癥程度，評價造模情況。將造模成功后的大鼠分為模型組和阿司匹林10 mg·kg-1組，每組10只，均再繼續(xù)ig給予脂肪乳3周;同時阿司匹林組每天14:00 ig給予阿司匹林。第4周，兩組動物停用脂肪乳，模型組繼續(xù)ig給予等體積蒸餾水，阿司匹林組繼續(xù)給予阿司匹林。

1.4 血清TC，TG，F(xiàn)BG和GPT水平的檢測

1.3分組處理大鼠末次給藥后所有大鼠禁食不禁水12 h，用4%水合氯醛麻醉后腹主動脈取血，膽固醇氧化酶-PAP法測定血清TC，磷酸甘油氧化酶-PAP法測定TG，比色法測定FBG和GPT。

1.5 肝重系數(shù)測定及肝組織病理學(xué)檢查

取肝臟稱重，肝重系數(shù)以每100 g體重肝臟所占的重量(g)計算表示。取大鼠肝臟組織，用10%甲醛溶液固定，石蠟包埋，切片后HE染色［9］，在光鏡下觀察肝組織的炎癥程度:-，無;+，平均10個高倍視野見炎癥細(xì)胞浸潤灶≤5個;++，平均10個高倍視野見炎癥細(xì)胞浸潤灶＞5個但＜10個;+++，平均10個高倍視野見炎癥細(xì)胞浸潤灶≥10個。

1.6 肝組織中TC，TG和MMP-9含量的檢測

每鼠稱取肝組織1 g，加三氯甲烷∶甲醇(1∶1，V/V)混合液至5 ml后勻漿，勻漿液置4℃ 24 h后離心，取上清10μl置另一試管中，室溫放置12 h以上，待三氯甲烷和甲醇揮發(fā)后，分別采用膽固醇氧化酶-PAP法和磷酸甘油氧化酶-PAP法測定肝組織勻漿的TC和TG含量。另取500 mg肝組織加冰生理鹽水制成10%勻漿，離心取上清，按ELISA試劑盒雙抗體夾心法測定MMP-9。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 阿司匹林對脂肪性肝炎模型大鼠總膽固醇，甘油三酯，空腹血糖水平和谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性的影響

與正常對照組相比，模型組大鼠血清TC，TG，F(xiàn)BG水平和GPT活性均顯著升高(P＜0.01或P＜0.05);阿司匹林治療4周后，血清TG，F(xiàn)BG水平和GPT活性較模型組均明顯降低(P＜0.01或P＜0.05)，但對血清TC水平無明顯改善作用(表1)。

2.2 阿司匹林對脂肪性肝炎大鼠肝重系數(shù)及肝組織結(jié)構(gòu)的影響

與正常對照組的肝重系數(shù)2.39±0.14相比，模型組肝重系數(shù)明顯升高(3.83±0.60，P ＜0.01);阿司匹林對肝重系數(shù)無改善作用(3.93±0.15)。HE染色結(jié)果顯示，正常對照組大鼠的肝臟結(jié)構(gòu)正常，未見有脂肪變性和炎癥細(xì)胞浸潤;模型組大鼠肝組織可見有脂肪變性、較多的炎性細(xì)胞浸潤及中心周圍壞死;阿司匹林治療4周后，大鼠肝組織中的炎性細(xì)胞明顯減少，但脂肪變性程度未見有明顯減輕(表2和圖1)。

表1 阿司匹林對脂肪性肝炎模型大鼠血清TC，TG，空腹血糖(FBG)和谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT)水平的影響Tab.1 Effects of aspirin on the serum TC，TG，fasting blood glucose(FBG)and glutamic pyruvic transaminase(GPT)levels in steatohepatitis rats

表2 阿司匹林對脂肪性肝炎模型大鼠肝組織病理變化的影響Tab.2 Effect of aspirin on the hepatic histopathological changes in steatohepatitis rats

圖1 阿司匹林對脂肪性肝炎模型大鼠肝組織病理變化的影響(HE ×100).動物處理見表1.A:正常對照組;B:模型組，可見有大小不等的脂質(zhì)空泡和較多的炎性細(xì)胞浸潤(箭頭所示);C:阿司匹林組，浸潤的炎癥細(xì)胞明顯減少，但脂質(zhì)空泡未見有明顯減少(箭頭所示).Fig.1 Effects of aspirin on the hepatic histopathological changes in steatohepatitis rats(HE ×100).

2.3 阿司匹林對脂肪性肝炎模型大鼠肝組織中總膽固醇，甘油三酯和基質(zhì)金屬蛋白酶9含量的影響

與正常對照組相比較，模型組大鼠肝臟組織中的MMP-9含量明顯升高(P＜0.05)，TC和TG含量也顯著增加(P＜0.01)。阿司匹林治療4周后，與模型組比較，可見大鼠肝組織中的MMP-9含量顯著降低(P＜0.01)，肝組織中TC和TG的含量雖有一定的降低，但無統(tǒng)計學(xué)差異(表3)。

表3 阿司匹林對脂肪性肝炎模型大鼠肝組織中基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)、總膽固醇(TC)和甘油三酯(TG)水平的影響Tab.3 Effects of aspirin on the matrix metalloproteinase-9(MMP-9)，total cholesterol(TC)and triglycerides(TG)contents in steatohepatitis rats

3 討論

本研究結(jié)果表明，高脂高糖誘導(dǎo)的脂肪性肝炎模型大鼠，其肝組織中可見有較多的炎癥細(xì)胞浸潤，并伴有局灶性壞死和血中GPT水平的升高。用阿司匹林治療后，肝組織中炎性細(xì)胞的浸潤明顯減少，血中GPT的水平也恢復(fù)至正常水平，提示阿司匹林對脂肪性肝炎具有一定的治療作用，這為阿司匹林新的臨床應(yīng)用提供了藥理學(xué)依據(jù)。

阿司匹林是一種傳統(tǒng)的抗炎藥，通過抑制COX活性來減少PG的合成。近年來有文獻(xiàn)報道，阿司匹林可以通過激活PPARα/γ來發(fā)揮其藥理學(xué)活性［6］，可以抑制腫瘤細(xì)胞和人冠狀上皮細(xì)胞中MMP-9的表達(dá)［10-11］。阿司匹林也可以通過激活PPARα/γ和抑制COX-2/前列腺素E合酶(prostaglandin Esynthase，PGES)-1途徑來減少人和小鼠腹腔巨噬細(xì)胞表達(dá)和釋放MMP-9［12-14］。本研究發(fā)現(xiàn)，阿司匹林可以減少脂肪性肝炎大鼠肝組織中MMP-9含量。由此推測，阿司匹林可能也是通過PPARα/γ和COX-2/PGES-1通路來抑制MMP-9的表達(dá)，而且這兩條通路可能是部分重疊而相互影響的。

MMP-9是MMP的一種，可導(dǎo)致膠原的分解，并與人類動脈粥樣斑塊破裂及急性缺血性心腦血管事件存在密切的聯(lián)系。MMP-9在大鼠肝臟主要由Kupffer細(xì)胞和星狀細(xì)胞產(chǎn)生，參與基底膜Ⅳ型膠原的代謝，降解正常肝竇基底膜，破壞肝臟細(xì)胞生存的微環(huán)境。本研究結(jié)果表明，脂肪性肝炎模型組大鼠肝組織中的MMP-9含量明顯較正常對照組升高，阿司匹林治療后MMP-9含量明顯降低，提示阿司匹林可能通過抑制肝臟MMP-9的產(chǎn)生，減少肝組織中膠原的降解，使血液中的炎癥細(xì)胞不易進(jìn)入肝臟組織，從而發(fā)揮抗炎作用;但另一方面，MMP-9的降低有可能加速脂肪性肝炎向脂肪性肝纖維化的發(fā)展。因此，MMP-9在脂肪性肝病不同階段的病理學(xué)意義值得進(jìn)一步探討。

已有文獻(xiàn)報道，阿司匹林可降低糖尿病代謝綜合征患者的血糖和血漿胰島素水平，改善IR［15］，也能降低IR大鼠的血漿胰島素水平，增加胰島素敏感性［16］。本研究結(jié)果表明，阿司匹林可以降低脂肪性肝炎大鼠血中的FBG水平，也提示阿司匹林可能有改善IR的作用。因?yàn)镹ASH的發(fā)生和發(fā)展與肝臟中脂質(zhì)蓄積造成的IR有關(guān)，脂質(zhì)的蓄積可造成過氧化及炎癥因子的分泌，炎性因子又可加強(qiáng)IR，阿司匹林可通過激活PPARα/γ抑制NF-κB而減少炎癥細(xì)胞因子的釋放［12］，從而改善IR。

綜上所述，阿司匹林雖不能改善脂肪性肝炎的肝臟脂肪變性，但可明顯改善脂肪性肝炎的炎癥狀態(tài)，對脂肪性肝炎可能具有一定的治療作用。

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