張啟云，李冰濤，徐國(guó)良，孫立波，湯喜蘭，黃麗萍，余日躍，劉紅寧

(1.江西中醫(yī)學(xué)院現(xiàn)代中藥制劑教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西南昌 330006;2.江西中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，江西南昌 330006)

代謝組學(xué)(metabonomics)是后基因時(shí)代出現(xiàn)的一門新的組學(xué)學(xué)科，主要是通過(guò)核磁共振，質(zhì)譜聯(lián)用定量檢測(cè)生物液如尿液，血液和膽汁等中相對(duì)分子質(zhì)量小于1000的內(nèi)源性物質(zhì)，結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)的方法對(duì)獲取的多維數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析，提取有用的數(shù)據(jù)信息，判定生物標(biāo)志物，再通過(guò)進(jìn)一步研究解釋藥物作用的機(jī)制［1］。代謝組學(xué)研究思路上的整體性和動(dòng)態(tài)性，與中醫(yī)藥理論的整體觀念是相一致的［2］，因此，將代謝組學(xué)的方法應(yīng)用到中醫(yī)藥研究中，有助于從整體上完整地了解中醫(yī)藥的作用機(jī)制。

干姜是一種基本的熱性中藥，目前尚未有文獻(xiàn)記載干姜對(duì)正常大鼠尿樣中內(nèi)源性代謝產(chǎn)物的影響。本文利用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的檢測(cè)平臺(tái)開(kāi)展對(duì)中藥材干姜水提物對(duì)SD大鼠尿液的代謝組學(xué)研究，并利用主成分分析(principal component analysis，PCA)，正交信號(hào)校正和偏最小二乘法判別分析(orthogonal signal correction-partial least square discriminate analysis，OSC-PLS-DA)化學(xué)計(jì)量學(xué)方法分析干姜的代謝組學(xué)特征，以期發(fā)現(xiàn)可作為生物標(biāo)志物的內(nèi)源性物質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、試劑和儀器

SD大鼠，雄性，體重220～240 g，江西中醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供，許可證號(hào):SCXK(贛)2006-0001，大鼠自由攝食飲水，溫度:21～25℃，日照時(shí)間12 h。干姜，產(chǎn)地四川犍為，家種統(tǒng)裝，產(chǎn)品批號(hào):20061003。干姜水提液提取的具體方法:400 g干姜切片，加10倍量水浸泡1 h，微沸回流提取1.5 h，過(guò)濾收集提取液;再相當(dāng)于原藥材重量的8倍量水提取1 h，合并2次水提液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮干姜水提液至6 kg·L－1(每升水提液相當(dāng)于6 kg干姜生藥材)。SIGMA3-18K低溫高速離心機(jī)(Sartorius公司，德國(guó))，Agilent1200 6410三重四極桿質(zhì)譜儀(Agilent公司，美國(guó))，電子分析天平(Sartorius公司，德國(guó))，甲酸(Fluka公司，美國(guó))，乙腈(Tedia公司，美國(guó))，水為去離子水，數(shù)據(jù)處理軟件為SIMCA-P11.0(Umetrics AB公司，瑞典)，SQL Server(Microsoft公司，美國(guó))，SPSS13.0(SPSS公司，美國(guó))。

1.2 動(dòng)物分組處理

20只大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組和干姜組，每組10只，干姜組大鼠每天14:00 ig給予干姜生藥0.72g·kg－1，每天 1 次，連續(xù) 30 d，正常對(duì)照組按 10 ml·kg－1給予蒸餾水。

1.3 尿液收集及樣品制備

正常對(duì)照組和干姜組大鼠分別于第0，1，8，15，22，29天收集14:00給藥后3 h內(nèi)尿液，－20℃保存。低溫解凍，4℃下15 493×g，離心5 min，取上清液0.5 ml加入甲醇 0.5 ml，混勻，在 4℃下靜置3 h，29 703 ×g離心10 min，取上清液，進(jìn)樣。

1.4 高效液相色譜-質(zhì)譜-質(zhì)譜法測(cè)定尿液中內(nèi)源性物質(zhì)

1.4.1 色譜條件

色譜柱:Agilent Zorbax Eclipse SB-C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)，流動(dòng)相:乙腈(A)、0.1%甲酸(B)流速:0.4 ml·min－1，進(jìn)樣量:3 μl，柱溫:35℃，運(yùn)行20 min。梯度洗脫條件如下:0～6 min(B:100%)，6～ 8 min(B:30%)，12～14 min(B:10%)，14.1～15 min(B:10%)，后運(yùn)行5 min。

1.4.2 質(zhì)譜條件

離子源模式:ESI正離子模式;毛細(xì)管電壓:4000V;霧化器壓力:275.8 kPa;干燥氣流速:10 L·min－1，干燥氣溫度:350℃，全掃描監(jiān)測(cè)得尿液總離子流色譜圖(total ion chromatogram，TIC)，提取質(zhì)譜信息，得到尿液樣品所含物質(zhì)的質(zhì)荷比(mass-tocharge，m/z)。

1.5 數(shù)據(jù)集及生物標(biāo)志物判定

使用SIMCA-P 12.0自帶程序進(jìn)行正交信號(hào)校正(OSC)，正交信號(hào)校正過(guò)程中，類別變量為Y變量。數(shù)據(jù)經(jīng)Pareto標(biāo)準(zhǔn)化后，進(jìn)行OSC-PLS-DA分析［3］。對(duì)OSC-PLS-DA模型中變量重要程度(variable importance，VIP)＞3的變量進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，VIP是反映變量對(duì)模型重要性的系數(shù)，VIP值越大，變量對(duì)模型越重要。生物標(biāo)志物是能夠代表外來(lái)刺激和內(nèi)源性生理改變的內(nèi)源性物質(zhì)，反映在OSC-PLS-DA模型上即是具有顯著差異的重要變量。在95%的置信度下變量?jī)?nèi)正常對(duì)照組與干姜組數(shù)據(jù)具有顯著差異的變量為生物標(biāo)志物［4］。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SIMCA-P 12.0多變量分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。組間比較采樣用獨(dú)立t檢驗(yàn)，兩兩比較采用SPSS13.0軟件和Hotelling T2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 干姜對(duì)大鼠尿液中內(nèi)源性物質(zhì)代謝影響的時(shí)間軌跡分析

將液相色譜-質(zhì)譜法掃描得大鼠尿液TIC(圖1)中獲取的正常對(duì)照組和干姜組大鼠尿液樣品所含物質(zhì)的豐度信息將數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化Excel數(shù)據(jù)表。對(duì)給藥后第0，1，8，15，22和29天正常對(duì)照組和干姜組大鼠尿液中內(nèi)源性物質(zhì)的豐度值均值做PCA分析。通過(guò)均值樣本點(diǎn)距離，以分析干姜對(duì)內(nèi)源性物質(zhì)代謝影響的時(shí)間軌跡，進(jìn)而比較各采樣時(shí)間點(diǎn)干姜對(duì)大鼠尿樣內(nèi)源性物質(zhì)的影響。時(shí)間軌跡分析過(guò)程，數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化使用Pareto，結(jié)果如圖2。

圖2結(jié)果表明隨著給藥時(shí)間的不同，正常對(duì)照組和干姜組各時(shí)間點(diǎn)的得分值都發(fā)生了變化，說(shuō)明時(shí)間因素可能對(duì)大鼠內(nèi)源性物質(zhì)有影響;其次，比較各時(shí)間點(diǎn)的正常對(duì)照組與干姜組的差異，給藥第8天正常對(duì)照組與干姜組尿樣均值樣本點(diǎn)間距離較其余時(shí)間點(diǎn)中兩組樣本點(diǎn)間距離大，表明第8天干姜對(duì)大鼠內(nèi)源性物質(zhì)代謝的影響比其他時(shí)間點(diǎn)大，因此，使用第8天數(shù)據(jù)分析干姜對(duì)大鼠尿樣代謝產(chǎn)物的影響。

圖1 液相色譜-質(zhì)譜法大鼠尿液的總離子流色譜圖.Fig.1 The total ion chromatogram of the rats.

圖2 時(shí)間對(duì)大鼠ig給予干姜后尿液中內(nèi)源性物質(zhì)的影響的主成分分析圖.干姜組大鼠每天14:00 ig給予干姜0.72 g·kg－1，正常對(duì)照組大鼠給予蒸餾水，連續(xù)30 d，收集給藥3 h后尿樣，液相色譜-質(zhì)譜法采集尿樣中內(nèi)源性物質(zhì)的質(zhì)荷比和豐度值，數(shù)據(jù)匹配后，對(duì)采樣時(shí)間點(diǎn)按組別分類的均值作主成分分析，主成分的分散點(diǎn)圖反映原始數(shù)據(jù)整體分布特征，以觀察干姜對(duì)內(nèi)源性物質(zhì)代謝影響的時(shí)間軌跡.△:正常對(duì)照組;▲:干姜組，0，1，8，15，22，29表示尿樣取樣時(shí)間點(diǎn).Fig.2 Principal component analysis(PCA)of data about effect of time on endogenous metabolites after rats were ig given Rhizoma Zingiberis.

2.2 給藥第8天干姜對(duì)大鼠尿液內(nèi)源性物質(zhì)影響的主成分分析

對(duì)給藥第8天正常對(duì)照組與干姜組尿樣中內(nèi)源性物質(zhì)豐度值主成分分析，得分圖見(jiàn)圖3，正常對(duì)照組與干姜組樣本點(diǎn)各自具有良好的聚類特征，兩組之間沒(méi)有樣本點(diǎn)重合，說(shuō)明在給藥第8天干姜對(duì)大鼠尿液中內(nèi)源性物質(zhì)的代謝的影響。

圖3 干姜對(duì)大鼠ig給予干姜第8天尿液內(nèi)源性物質(zhì)影響的主成分得分圖.動(dòng)物分組給藥見(jiàn)圖2.△:正常對(duì)照組;▲:干姜組.Fig.3 PCA score plot of data about effect of Rhizoma Zingiberis on endogenous metabolites after rats were ig given Rhizoma Zingiberis at d 8.

2.3 給藥第8天干姜對(duì)大鼠尿液內(nèi)源性物質(zhì)影響的OSC-PLS-DA分析

除干姜因素外，大鼠的個(gè)體差異，飲食，晝夜變化等都會(huì)影響大鼠尿樣中內(nèi)源性物質(zhì)的代謝，將嚴(yán)重影響分析結(jié)果的正確性。正交信號(hào)校正(OSC)是一種基于偏最小二乘法的濾噪方法，能夠消除與Y(分類變量)變量正交成分(飲食等外界因素的數(shù)據(jù)信息)，保留有效的數(shù)據(jù)信息，提高模型的有效性和解釋能力。

使用SIMCA-P 11.0自帶的程序所得正交信號(hào)對(duì)本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行校正，校正過(guò)程中以組別變量為Y變量，刪除前兩個(gè)與Y變量正交成分。正交信號(hào)校正前刪除差異樣本點(diǎn)8rz3。正交信號(hào)校正后建OSCPLS-DA 模型。模型的 R2X=0.721，R2Y=0.999，Q2=0.971，即擬合后的模型能解釋72.1%X變量，99.9%Y變量。Q2=0.971，表明經(jīng)7倍交叉有效性檢驗(yàn)?zāi)Ｐ陀行?。圖4和圖5分別為OSC-PLS-DA模型的得分圖及相應(yīng)的載荷圖。與圖3相比較，圖4中正常對(duì)照組與干姜組樣本有更好的分離趨勢(shì)，且組內(nèi)差異變小，表明OSC-PLS-DA比PCA具有更好的分類能力。正常對(duì)照組和干姜組樣本點(diǎn)在得分圖中沿第一主成分分開(kāi)。第一主成分主要包含干姜水提液對(duì)大鼠尿樣代謝產(chǎn)物影響的數(shù)據(jù)信息，因此應(yīng)提取第一主成分VIP變量。圖5顯示多數(shù)變量在原點(diǎn)附近，少數(shù)變量偏離原點(diǎn)，對(duì)模型有重要影響，所代表的物質(zhì)為可能的生物標(biāo)志物。

圖4 干姜對(duì)大鼠ig給予干姜后第8天尿液內(nèi)源性物質(zhì)影響的OSC-PLS-DA分析得分圖.動(dòng)物分組給藥見(jiàn)圖2.△正常對(duì)照組;▲干姜組.Fig.4 OSC-PLS-DA score plot about effect of Rhizoma Zingiberis on endogenous metabolites after rats were ig given Rhizome Zingiberis at d 8.

圖5 干姜對(duì)大鼠ig給予干姜第8天尿液內(nèi)源性物質(zhì)影響的OSC-PLS-DA分析的載荷圖.動(dòng)物分組給藥見(jiàn)圖2.▲:以質(zhì)荷比命名的變量，□內(nèi)為可能生物標(biāo)志物變量.Fig.5 Loading plots of OSC-PLS-DA about effect of Rhizoma Zingiberis on endogenous metabolites after rats were ig given Rhizoma Zingiberis at d 8.

2.4 可能受干姜影響的大鼠尿液內(nèi)生物標(biāo)志物

采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用篩查內(nèi)源性物質(zhì)信息，依據(jù)內(nèi)源性物質(zhì)數(shù)據(jù)對(duì)OSC-PLS-DA模型的影響和生物標(biāo)志物的統(tǒng)計(jì)學(xué)特征篩查生物標(biāo)志物。由于干姜具有成分復(fù)雜、藥理作用廣泛的特點(diǎn)，提取一種物質(zhì)來(lái)表示干姜對(duì)大鼠內(nèi)源性物質(zhì)的影響，難以全面描述干姜對(duì)大鼠內(nèi)源性物質(zhì)的影響作用。因此將VIP值大于3.0，獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)(95%)正常對(duì)照組和干姜組數(shù)據(jù)具有顯著性差異的變量定義為生物標(biāo)志物變量。通過(guò)查找相關(guān)網(wǎng)站HMDB/KEGG/METLIN，初步確定可能生物標(biāo)志物如表1。

表1 干姜影響大鼠尿液內(nèi)源性物質(zhì)的可能生物標(biāo)志物Tab.1 Possible biomarkers in endogenous metabolites affected by Rhizoma Zingiberis after Rhizoma Zingiberis was ig given in rats for 30 d

3 討論

干姜為姜科植物姜(Zingiber officinale Rosc.)的干燥根莖，又名白姜、均姜。中醫(yī)的理論認(rèn)為干姜為熱性中藥，具有溫中散寒、回陽(yáng)救逆、燥濕消痰的功用［5］。臨床用來(lái)治療腸炎，腹瀉，嘔吐，冠心病，心肌梗死等疾病?，F(xiàn)代藥理研究表明，干姜具有鎮(zhèn)痛抗炎，保肝利膽，抗?jié)?，改善心血管系統(tǒng)等藥理活性［6］。本研究結(jié)合代謝組學(xué)的方法，研究了干姜水提物的灌胃大鼠尿液代謝組特征，初步篩選10種生物標(biāo)志物來(lái)標(biāo)記干姜水提物對(duì)大鼠內(nèi)源性物質(zhì)的影響。其中，磷脂酸具有刺激血小板聚集，平滑肌收縮，體內(nèi)血管活性等生物活性。孕烯醇酮硫酸鹽屬腎上腺皮質(zhì)激素類物質(zhì)。這兩種物質(zhì)的變化與熱性中藥在心血管中的藥理作用和溫?zé)嶂兴帉?duì)內(nèi)分泌系統(tǒng)的影響具有一定的相關(guān)性［7－8］。神經(jīng)酰胺-1-磷酸能夠通過(guò)易位和激活細(xì)胞質(zhì)磷脂酶A2而誘導(dǎo)花生四烯酸和前列腺素的合成［9］?；ㄉ南┧岷颓傲邢偎厥茄装Y的主要介質(zhì)，文獻(xiàn)報(bào)道干姜是通過(guò)降低細(xì)胞質(zhì)磷脂酶A2的活性而發(fā)揮抗炎作用的［15］。因此，可以推斷干姜抗炎作用的傳導(dǎo)細(xì)胞信號(hào)可能是神經(jīng)酰胺-1-磷酸。

本研究結(jié)果表明，干姜在大鼠尿液中生物標(biāo)志物的變化與干姜藥理、藥性的研究成果一致，為熱性中藥藥性理論研究提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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