石杜娟,徐元宏,胡元生,周銀娣,劉麗麗,鐘政榮,羅慶禮,沈繼龍

2.安徽醫(yī)科大學第三附屬醫(yī)院檢驗科,合肥 230061;

3.安徽醫(yī)科大學人獸共患病研究所,合肥 230032;

血吸蟲病是我國現(xiàn)階段沿江地區(qū)面臨的重要公共衛(wèi)生問題之一。目前我國血吸蟲病流行區(qū)包括了沿江7個省,至少有約3 000萬人受血吸蟲病的威脅〔1-3〕。我國為日本血吸蟲病流行區(qū),也是血吸蟲病危害最嚴重的4個國家之一〔4〕。

酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase,TH)是兒茶酚胺(Catecholamine,CA)類物質合成過程中的限速酶〔5-6〕,T H通過復雜的調節(jié)過程催化絲氨酸產(chǎn)生多巴胺,腎上腺素,去甲腎上腺素等兒茶酚胺類物質,調節(jié)血吸蟲蟲體肌肉的活動度及成蟲的產(chǎn)卵率〔6-7〕,可為血吸蟲病的分子干預環(huán)節(jié)、藥物開發(fā)、新型疫苗的設計和信號傳導通路干擾等研究開辟新途徑〔8〕。因此,通過研究 TH 的活性來調控CA 的合成,對日本血吸蟲的生長發(fā)育以及感染能力有很重要的意義,本研究通過 RACE PCR擴增出SjTH的編碼基因,并在真核表達系統(tǒng)中觀察其表達情況,為后續(xù)對CA調控的干擾來觀察日本血吸蟲的產(chǎn)卵率和致病情況奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 主要材料和試劑 釘螺(江蘇血吸蟲病防治研究所);抗His標簽單克隆抗體(購于北京普利來基因技術有限公司);TRIzol、DMEM 培養(yǎng)基、Lipofectamine2000試劑(購于Invitrogen公司);DEPC(購于 Amresco公司);Ex Taq DNA聚合酶、dNTP 、DNA M arker(DL2000)、T-載體(pGEM-T Vector)、T4連接酶、限制性核酸內切酶EcoR I、NotI(購于TaKaRa公司);RT-PCR試劑盒(購于 Promega公司);小牛血清(杭州四季青);真核表達載體 pcDNA3.1(+)質粒;大腸桿菌XL1-blue、DH5a(安徽醫(yī)科大學人獸共患病研究所);質粒小量提取試劑盒、DNA純化回收試劑盒(購于AXYGEN公司)、醋酸纖維膜(Hybond-C Membrane購于 Amersham Biosciences公司)。

1.2 引物的設計與合成 根據(jù)本實驗室SjTH基因序列,用Primer5.0軟件設計出SjTH的引物序列如下：上游引物：5′-CGGAAT TCA TGCTTAACGTATGTGACAGAAACAC-3′(EcoR I);下 游 引 物：5′-CCGCGGCCGCTTAGTCACGATAT TCTATGCTAACAG-3′(NotI)。引物由上海生物工程有限公司合成。

1.3 日本血吸蟲成蟲總RNA的提取 取出多條日本血吸蟲成蟲將其轉移入研缽中,加入T RIzol 1mL后研磨勻漿5min,再轉入 DEPC處理過的 1.5mL EP管中,置冰上10min;室溫孵育5min后,加0.5mL氯仿,用力振蕩15s后,室溫孵育3min,4℃12 000g 15min;再將上層液相轉移至新的EP中,加入0.5mL異丙醇,充分混勻,室溫孵育10min,4℃12 000g 10min;棄去上清液,在管中加 1mL的75%乙醇,漩渦振蕩混勻,4℃7 500g 5min;然后短暫干燥 RNA后,加 40μ L DEPC 溶解 RNA。

1.4 日本血吸蟲成蟲總RNA反轉錄成cDNA 參照Promega公司的RT-PCR試劑盒說明書進行逆轉錄反應,取5μ L聚合酶鏈反應產(chǎn)物以1%的瓊脂糖凝膠進行電泳分析。

1.5SjTH基因原核亞克隆質粒pGEM-T-SjTH的構建上述聚合酶鏈反應產(chǎn)物SjTH按照DNA純化回收試劑盒說明進行PCR產(chǎn)物純化回收,回收后的產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠進行電泳。將回收后的SjTH基因片段和pGEM-T載體用T4連接酶4℃連接過夜。制備感受態(tài)細胞XL1-blue,然后涂布于 LB/Amp/IPTG/X-gal平板,37℃培養(yǎng)過夜。挑取6個白色菌落,置于LB/Amp液態(tài)培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜,用試劑盒小量提取質粒DNA(pGEM-T-SjT H),經(jīng)EcoR I和NotI雙酶切,1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定,正確的重組質粒命名為pGEM-T-SjT H。重組基因的核苷酸由上海華大基因公司進行測序。

1.6SjTH基因真核表達質粒的構建和鑒定 分別對pGEM-T-SjTH質粒和pcDNA3.1(+)載體質粒進行EcoR I和NotI雙酶切,并按照DNA純化回收試劑盒說明,切膠純化酶切的pGEM-T-SjT H小片段SjTH和pcDNA3.1(+)載體質粒大片段。將pcDNA3.1(+)載體與SjT H片段用Solution I 4℃連接過夜。制備感受態(tài)細胞DH5a,然后涂布于LB/Kana平板,37℃培養(yǎng)過夜。隨機挑取4個白色菌落,置于LB/Kana液態(tài)培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜,用試劑盒提取質粒DNA(pcDNA3.1(+)-SjTH),經(jīng)EcoR I和NotI雙酶切后,進行1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定,鑒定后送上海華大基因公司進行測序。測序鑒定正確的重組質粒命名為pcDNA3.1(+)-SjTH。

1.7 pcDNA3.1(+)-SjTH轉染入COS-7細胞及SjTH蛋白的表達與鑒定 將凍存的COS-7細胞復蘇后用含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基,在37℃5%CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng),3d換液1次,傳代3～4次使細胞達到良好的生長狀態(tài)。轉染前24h用胰蛋白酶消化貼壁的COS-7細胞,再以無血清無雙抗的DMEM培養(yǎng)基重懸細胞,并按5×105∕ L密度接種于6孔板培養(yǎng)皿中,37℃5%CO2培養(yǎng)至細胞融合度為60%～80%。取1.5mL的 EP管,加入2μ g純化后的無內毒素重組質粒(pcDNA3.1(+)-SjTH),溶于 100μ L無血清無雙抗的DMEM培養(yǎng)基中,混勻后室溫放置30min即為A液。取10μL Lipofectamine2000溶于 100μ L無血清無雙抗的DM EM培養(yǎng)基中,混勻后室溫放置30min得到B液。將A、B液混勻,置室溫下孵育15min以形成DNA-脂質體復合物。同時從 6孔板培養(yǎng)皿中吸出培養(yǎng)基,用無血清的DM EM培養(yǎng)基輕輕沖洗待轉染的COS-7細胞一遍,加入800μ L的無血清 DMEM培養(yǎng)基。再將200μ L的AB混合液逐滴加入孔中,輕輕搖動培養(yǎng)板使其混勻。在37℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),5h后更換含有血清和雙抗的完全培養(yǎng)基。轉染時,設置正常的COS-7細胞和轉染空載體pcDNA3.1(+)為對照。轉染48h后,改用含800μ g/mL G418、10%小牛血清的高糖 DMEM 篩選培養(yǎng)液培養(yǎng),每3d換液 1次,直至出現(xiàn)成團生長的轉染細胞集落。收集部分細胞進行 RTPCR和Western blot鑒定。

2 結 果

2.1SjTH編碼基因的擴增結果 RACE PCR擴增SjTH 3′和5′末端,測序,拼接預測編碼基因序列,再次擴增完整的編碼序列,亞克隆入pGEM-T載體,測序證實SjTH編碼基因有1 392bp。結果見圖1。

2.2 原核克隆載體pGEM-T-SjT H的構建及鑒定原核目的基因連接入原核克隆載體pGEM-T后轉化入大腸桿菌XL1-blue原核,挑選 4個克隆,PCR篩選出3個陽性克隆。2號克隆經(jīng)EcoR I和Not I雙酶切鑒定,見圖2。

2.3 真核表達載體pcDNA3.1(+)-SjTH的構建及鑒定 真核目的基因連接入真核表達載體pcDNA3.1(+)后轉化入大腸桿菌DH5a,挑選4個克隆,PCR結果4個都為陽性克隆。2號克隆經(jīng)EcoR I和NotI雙酶切鑒定見圖2。結果顯示重組質粒構建成功。

圖1 SjTH cDNA及推測的相應SjTH蛋白氨基酸序列注：經(jīng)RACE PCR可知SjTH的開放讀碼框(ORF)從A TG到TAA總共1 392bp,可生成463個氨基酸,用線畫的兩條信號肽是經(jīng)鑒定的氨基酸序列。Fig.1 cDNA and deduced amino acid sequence of Schistosoma japonicum tyrosine hydroxylaseThe ORF of SjTH originated from ATG and ended in TAA for 1 392bp obtained by RACE PCR,463 amino acids were deduced.Two signal peptides underlined with lines were identified in the amino acid sequnece

2.4SjT H蛋白的真核表達及鑒定 將轉染真核表達載體pcDNA3.1(+)-SjT H后的COS-7細胞、轉染pcDNA3.1(+)和正常的COS-7細胞進行逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)見圖3。結果顯示在轉染真核表達載體 pcDNA3.1(+)-SjTH后的COS-7細胞處出現(xiàn)陽性條帶,說明轉染成功。

2.5SjT H基因在COS-7細胞中的表達 將轉染真核表達載體pcDNA3.1(+)-SjTH后的COS-7細胞、轉染pcDNA3.1(+)和正常的COS-7細胞進行Western blot鑒定。結果顯示只有轉染真核表達載體pcDNA3.1(+)-SjT H后的COS-7細胞處出現(xiàn)陽性條帶,說明有目的基因表達,見圖4。

3 討 論

兒茶酚胺(CA)類是神經(jīng)系統(tǒng)信息傳輸?shù)纳窠?jīng)遞質,作為激素釋放的腎上腺素和去甲腎上腺素具有交感神經(jīng)興奮心血管及促進能量代謝作用。酪氨酸羥化酶催化L-酪氨酸轉化成L-多巴,它是兒茶酚胺類合成過程中的限速酶,在CA的神經(jīng)傳遞和激素作用的過程中起著核心作用〔9〕。編碼T H的基因已經(jīng)從大部分的哺乳動物和其他脊椎動物中分離出來〔10〕。據(jù)報道：寄生蠕蟲有芳香族氨基酸羥化酶,并且曼氏血吸蟲可以用像高級生物那樣用同樣的酶反應途徑合成它們自己的內源性CA〔11〕。而CA合成的第一步就需要被TH催化,這種酶可以使酪氨酸轉換為短暫存在的中間產(chǎn)物L-多巴。L-多巴經(jīng)過多步酶聯(lián)反應,很快依次代謝產(chǎn)生多巴、去甲腎上腺素和腎上腺素。TH催化這個途徑的第一個限速反應并控制CA產(chǎn)生速度。SjTH長1 392bP,分子量54kD.TH通過復雜的調節(jié)過程催化絲氨酸產(chǎn)生兒茶酚胺類物質,調節(jié)血吸蟲蟲體肌肉的活動度及成蟲的產(chǎn)卵率?，F(xiàn)已知在人體,可以通過維甲酸受體上游的啟動子從轉錄水平調節(jié)T H的基因表達〔12〕,酪氨酸羥化酶表達下降則可直接引起兒茶酚胺合成下降。本研究借鑒前人對曼氏血吸蟲SmT H的研究來探討日本血吸蟲 TH的功能。在曼氏血吸蟲中,目前已有實驗結果證明SmTH有以下特點：①在結構和催化活性上同哺乳動物相似;②重組表達的曼氏血吸蟲 T H有兩種亞型,含有465個氨基酸,分子量為54kD;③純化的酶活性需有與哺乳動物相同的輔助因子四氫生物喋玲;④受產(chǎn)物負反饋調節(jié);⑤兒茶酚胺類物質在蟲體內與5-羥色胺(5-H T)相互作用,影響蟲體的肌肉收縮和成蟲的產(chǎn)卵率〔12〕;⑥體內多種信號蛋白如14-3-3蛋白可通過蛋白質間的相互作用激活磷酸化的TH產(chǎn)生多巴胺等 CA類物質〔13〕,CDK11p110和CK2通過14-3-3蛋白結合到T H Ser19,降低了磷酸化的TH去磷酸化速率而負性調節(jié)TH生物學活性〔14〕。

圖4 轉染后目的蛋白SjTH的Western Blotting和SDSPAGE鑒定M：蛋白分子量標準;1和 2：轉染 pcDNA3.1(+)-SjTH后的COS-7細胞Western blot;3：轉染pcDNA3.1(+)-SjTH后的COS-7細胞SDS-PAGE;4：正常的 COS-7細胞SDS-PAGE;5：純化后的 SjTH蛋白Fig.4 Identification of the expression of the protein SjTH after trasfection pcDNA3.1(+)-SjTH in COS-7 cells by Western Blotting and SDS-PAGEM ：protein marker;1～ 2：Identification by Western blot;3：Identification by SDS-PAGE;4：the normal COS-7 cells;5：The protein SjTH after purification

本實驗的意義就在于通過重組真核表達載體pcDNA3.1(+)-SjTH,將其轉染入COS-7細胞中,獲得有活性的SjTH蛋白。以繼續(xù)研究SjTH蛋白酶的活性,以及是否與曼氏血吸蟲中的T H一樣,14-3-3蛋白能否通過蛋白質間的相互作用激活磷酸化的TH產(chǎn)生多巴胺等CA類物質,并且通過對酪氨酸羥化酶信號通路上游分子Sj14-3-3信號蛋白的干預,調控酶活性,影響兒茶酚胺類物質的合成,以抑制血吸蟲肌肉的興奮性和降低成蟲的產(chǎn)卵率,減弱其對血管的吸附能力及減少蟲卵負荷,為血吸蟲經(jīng)基因沉默的生物治療尋找新的途徑。

〔1〕Chen H,Lin D.T he prevalence and control of schistosomiasis in Poyang Lake region,China〔J〕.Parasitol Int,2004,53 ：115-125.

〔2〕Zhou XN,Wang LY,Chen MG,et al.The public health significance and control of schistosomiasis in China--then and now〔J〕.Acta Trop,2005,96：97-105.

〔3〕M cManus DP,Li Y,Gray DJ,et al.Conquering'snail fever'：schistosomiasis and its control in China〔J〕.Ex pert Rev Anti Infect Ther,2009,7：473-85.

〔4〕Utzinger J,Zhou XN,Chen MG,et al.Conquering schistosomiasis in China：the long march〔J〕.Acta Trop,2005,96：69-96.

〔5〕Nagatsu T.The human ty rosine hydroxy lase gene〔J〕.Cell M ol Neurobiol,1989,9：313-21.

〔6〕Fitzpatrick PF.T he aromatic amino acid hydroxylases〔J〕.Adv Enzy mol Relat Areas Mol Biol,2000,74：235-94.

〔7〕Hamdan FF,Ribeiro P.Cloning and characterization of a novel form of ty rosine hydroxy lase from the human parasite,Schistosoma mansoni〔J〕.J Neurochem,1998,71 ：1369-80.

〔8〕Dissous C,Ahier A,Khayath N.Protein tyrosine kinases as new potential targets against human schistosomiasis〔J〕.Bioessays,2007,29：1281-8.

〔9〕Lapa M,Dias B,Jardim C,et al.Cardiopulmonary manifestations of hepatosplenic schistosomiasis〔J〕.Circulation,2009,119 ：1518-1523.

〔10〕Nakashima A,Hayashi N,Kaneko YS,et al.Role of N-terminus ofty rosine hydroxylase in the biosynthesis ofcatecholamines〔J〕.J Neural T ransm,2009 Nov,116(11)：1355-1362.

〔11〕Neckameyer W,Quinn W.Isolation and characterization of the gene for Drosophila tyrosine hydroxylase〔J〕.Neuron,1989,2,1167-1175.

〔12〕Hamdan FF,Ribeiro P.Cloning and characterization of a novel form of tyrosine hydroxylase from the human parasite,Schistosoma mansoni〔J〕.Journal of neurochemistry,1998,71(4)：1369-1380.

〔13〕Fujisawa H,Okuno S.Regulatory mechanism of tyrosine hydroxylase activity〔J〕.Biochemical and biophysical research communications,2005,338：271-276.

〔14〕Sachs NA,Vaillancourt RR.Cyclin-dependent kinase 11p110 and casein kinase 2(CK2)inhibit the interaction between ty rosine hydroxylase and 14-3-3〔J〕.Journal of neurochemistry,2004,88：51-62.