劉學(xué)祿,張宏梅,謝麗斯

(廣東工業(yè)大學(xué)輕工化工學(xué)院,廣州 510006)

細(xì)菌耐藥性問題已經(jīng)引起人類普遍關(guān)注,“超級(jí)細(xì)菌”的出現(xiàn)再次向人類濫用抗生素敲響了警鐘。以往人類把細(xì)菌耐藥性的研究重點(diǎn)多集中在臨床致病菌上,對(duì)于環(huán)境中微生物的耐藥監(jiān)測(cè)研究材料相對(duì)缺乏。近年來,越來越多的研究人員開始關(guān)注非臨床環(huán)境的微生物的耐藥性及其在耐藥性傳播中的作用。尤其是在畜牧養(yǎng)殖中,消毒劑及抗生素的濫用造成動(dòng)物源食品中出現(xiàn)大量的耐藥性微生物,并有可能通過食物鏈進(jìn)行傳播,對(duì)人類的健康造成一定的威脅。整合子細(xì)菌耐藥性在耐藥性的傳播中起到重要的作用,它是一種能識(shí)別并捕獲外源性可移動(dòng)基因、具有位點(diǎn)特異性的基因重組系統(tǒng)。整合子通過位點(diǎn)特異性基因重組機(jī)制使細(xì)菌耐藥基因盒整合在一起,形成多種耐藥基因的組合和排列,導(dǎo)致不同的耐藥基因在共居一個(gè)系統(tǒng)的微生物群落間相互傳播[1]。研究動(dòng)物源食品中耐藥微生物整合子的特征,對(duì)于當(dāng)前研究食物鏈中微生物耐藥性的傳播,尤其是多重耐藥性有著非常重要的意義。本文對(duì)一畜牧養(yǎng)殖場(chǎng)分離的 22株耐藥微生物的 I類整合子及其整合的基因盒進(jìn)行了檢測(cè),并分析了整合子對(duì)細(xì)菌耐藥性的影響。

1 材料與方法

1.1 培養(yǎng)基 LB肉湯培養(yǎng)基,用于細(xì)菌的培養(yǎng)。季銨鹽抗性菌株篩選培養(yǎng)基,在 LB培養(yǎng)基中添加濃度為 25μg/mg的苯扎溴銨。

1.2 菌株的篩選與鑒定 樣品來源于廣州一養(yǎng)殖場(chǎng)的雞糞樣品、雞食槽料、雞場(chǎng)土壤和水樣。在選擇培養(yǎng)基上生長的菌株經(jīng)過重復(fù)劃線純化后,進(jìn)行革蘭氏染色、接觸酶實(shí)驗(yàn)、氧化酶實(shí)驗(yàn)、葡萄糖產(chǎn)氣實(shí)驗(yàn)、H2S實(shí)驗(yàn)、靛基質(zhì)實(shí)驗(yàn)、檸檬酸鹽實(shí)驗(yàn)、葡萄糖酸鹽的氧化實(shí)驗(yàn)、甲基紅實(shí)驗(yàn)、尿素酶實(shí)驗(yàn)、苯丙氨酸實(shí)驗(yàn)、賴氨酸及鳥氨酸實(shí)驗(yàn),共分離鑒定 22株菌。

1.3 藥敏檢測(cè) 采用 K-B法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。普通瓊脂和水解酪蛋白 Mueller-Hinton(MH)瓊脂,由廣東工業(yè)大學(xué)食品與生物工程系生物工程實(shí)驗(yàn)室配制。選用 10種常用抗生素：氨芐西林、頭孢噻吩、氯霉素、復(fù)方新諾明、四環(huán)素、鏈霉素、磺胺、慶大霉素、卡那霉素、壯觀霉素,以上抗生素紙片購自杭州天和生物試劑有限公司。實(shí)驗(yàn)用標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照菌株與檢測(cè)菌株平行測(cè)定,質(zhì)量控制對(duì)照菌株為大腸桿菌 ATCC25922(CMCC44113),購自中國藥品生物制品檢定所。藥敏方法和結(jié)果判斷參照美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)標(biāo)準(zhǔn)(CLSI)[2]。

1.4 PCR法檢測(cè)第 I類整合子 采用 PCR方法檢測(cè)第一類整合酶基因(intI)和耐藥基因盒,PCR為50μL體系,引物序列、總體積組成及擴(kuò)增條件參照文獻(xiàn)[3],引物由 TAKARA生物公司合成。產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳、溴化乙錠(EB)溶液染色,在凝膠成像系統(tǒng)照相檢測(cè)。采用的陽性對(duì)照和陰性對(duì)照由華南理工大學(xué)石磊教授所贈(zèng)。

1.5 耐藥基因盒的序列分析 擴(kuò)增后的耐藥基因盒序列檢測(cè)由上海英俊生物技術(shù)有限公司完成,使用 Genetyx-version7.0軟件以及在 www.ncbi.nlm.nih.gov網(wǎng)站對(duì)序列進(jìn)行分析,應(yīng)用 Nucleotide BLAST對(duì)獲得的基因片段進(jìn)行同源性檢索。

2 結(jié)果

2.1 菌株的篩選鑒定 通過生化分析實(shí)驗(yàn),菌株初步鑒定為 14株大腸桿菌、6株沙門氏菌、2株產(chǎn)氣腸桿菌。

2.2 菌株對(duì)抗生素的敏感性實(shí)驗(yàn) 22株菌的藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖 1)表明,每株菌至少對(duì) 3種抗生素耐藥,其中耐復(fù)方新諾明的菌株最多,22株(100%),耐氨芐西林的菌株有 18株(81%),耐四環(huán)素的菌株有 16株(72%),耐磺胺的菌株有 16株(72%),耐鏈霉素的菌株有 14株(65%),耐卡那霉素的菌株有 12株 (54%),耐氯霉素的菌株有 12株(54%),耐壯觀霉素的菌株有 10株(46%),耐慶大霉素的菌株有 10株(46%),耐頭孢噻吩的菌株有 6株(27%)。

圖1 22株菌的藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3 第 I類整合子的檢測(cè)結(jié)果 22株菌擴(kuò)增第 I類整合酶基因(intI)的凝膠電泳結(jié)果表明,全部得到923 bp的擴(kuò)增產(chǎn)物,大小與整合子相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道相同[4],均鑒定為第一類整合子陽性菌株。

2.4 耐藥基因盒序列分析 22株菌耐藥基因盒特異性引物擴(kuò)增整合子可變區(qū)的結(jié)果表明,只有 11株檢測(cè)到耐藥基因盒。其中,從 8株菌擴(kuò)增得到1803 bp的 PCR產(chǎn)物,對(duì) 1803 bp片段進(jìn)行測(cè)序,序列分析表明該片段與耐藥基因盒 dfrA12+orfF+aadA2(GU001949,57～1859 bp)100%同源,其中dfrA12是編碼對(duì)甲氧芐啶藥物產(chǎn)生耐藥的基因,aadA2是編碼對(duì)氨基糖苷類抗生素產(chǎn)生耐藥的基因。對(duì)于 orfF是一未知的基因盒,未有報(bào)道其編碼的產(chǎn)物。從 8株菌擴(kuò)增得到 1570 bp的 PCR產(chǎn)物,對(duì) 1570 bp片段進(jìn)行測(cè)序,序列分析表明該片段與耐藥基因盒 aadA5和 dfr17(AB188270,47～1616 bp)100%同源,該耐藥基因分別對(duì)氨基糖苷類抗生素和甲氧芐啶藥物產(chǎn)生耐藥。從 2株菌擴(kuò)增得到419 bp的 PCR產(chǎn)物 (與 AP006725,1823390～1823784 bp 100%同源),經(jīng)分析得知其是一種 ATP依賴型蛋白,其功能是編碼微生物對(duì)熱產(chǎn)生抗性[5]。從 4株菌擴(kuò)增得到 155 bp的 PCR產(chǎn)物(HM569736,1054～1206 bp 100%同源),經(jīng)序列分析為耐藥基因盒的整合位點(diǎn),為重復(fù)序列和反向重復(fù)序列,可見是空基因盒。

3 討論

由于在 I類整合子的結(jié)構(gòu)中,3'保守片段均含有一個(gè) qac△E,其對(duì)季銨鹽類藥物產(chǎn)生抗性[6]。本研究采用一定濃度的季銨鹽藥物培養(yǎng)基,目的是能更加高效地篩選到整合子陽性的多重耐藥的菌株。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明,篩選得到 22株菌,I類整合子均為陽性?？梢?菌株對(duì)季銨鹽藥物的表現(xiàn)型和整合子結(jié)構(gòu)所在的基因型是相符合的。

本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)的第一類整合子的分析顯示,在 8株菌的 1570 bp耐藥基因盒中含有 aadA5和 dfr17耐藥基因盒,是編碼抗壯觀霉素、鏈霉素和復(fù)方新諾明的耐藥基因。在 8株菌的 1803 bp耐藥基因盒中含有aadA2和dfrA12耐藥基因盒,是編碼抗壯觀霉素、鏈霉素和復(fù)方新諾明的耐藥基因。另外,4株攜帶空耐藥基因盒、2株攜帶抗熱性基因的菌株,由于其具有整合子的結(jié)構(gòu),所以含有 3'保守端的sulI,該基因編碼產(chǎn)物對(duì)磺胺類藥物產(chǎn)生耐藥[6]。在藥敏試驗(yàn)中,16株菌耐四環(huán)素、18株菌耐氨芐西林,但未檢測(cè)到其相關(guān)的耐藥基因盒。其原因可能在于相關(guān)耐藥基因并不在整合子上,有待于對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

本實(shí)驗(yàn)中所用菌株均分離自環(huán)境,檢測(cè)第一類整合子的陽性率為 100%,表明這些菌株面臨著相對(duì)較高的抗生素選擇壓力。近年來,對(duì)整合子系統(tǒng)介導(dǎo)的細(xì)菌耐藥已經(jīng)成為研究的熱點(diǎn)。在國外,研究者不僅從臨床菌株,而且從環(huán)境和牲畜分離的菌株中都檢測(cè)到整合子介導(dǎo)細(xì)菌耐藥性的存在[7-8]。環(huán)境中整合子陽性菌株的出現(xiàn),對(duì)人們合理應(yīng)用抗生素和積極監(jiān)測(cè)細(xì)菌耐藥性提出了更高的要求。耐藥菌株通過食物鏈進(jìn)行傳播,并有可能在人體內(nèi)進(jìn)行積累,為傳染病的暴發(fā)及流行提供了可能性。本研究提示人類,不僅應(yīng)從表型上,更應(yīng)該從基因水平上全面系統(tǒng)地開展對(duì)細(xì)菌的耐藥性監(jiān)測(cè)。

[1] 戴曉莉,蘇兆亮,陳建國,等.臨床分離的革蘭氏陰性菌 3類整合酶基因的篩查與 I類整合子結(jié)構(gòu)分析[J].中國感染與化療雜志,2009,9(1)：52-55.

[2] CLSI.Performance Standards for Anti—microbia1 Susceptibility Testing;Eleventh Informational Supplement[S].

[3] 張宏梅,石 磊,李 琳,等.沙門氏菌中第I類整合子的鑒定及特性分析[J].中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志,2004,24(3)：214-2l7.

[4] 石 磊,竹田美文,山崎伸二,等.印度霍亂菌株整合子的解析[J].日本細(xì)菌學(xué)雜志,2002,57(2)：179.

[5] Yoko K,Susan G,Janet P,etal.The Two-component,ATP-dependent Clp Protease of E.coli[J].JBio Chemistry,1988,263(29)：15226-15236.

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