符華林,戴玉嬌

(四川農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院藥學系,四川雅安 625014)

泰樂菌素是從弗氏鏈霉菌的培養(yǎng)液中提取獲得的一種大環(huán)內(nèi)酯類動物專用型抗生素,主要作用于革蘭氏陽性菌和支原體,對部分革蘭氏陰性菌、螺旋體、球蟲和某些真菌都有不同程度的抑制作用[1]。作為治療藥物,泰樂菌素廣泛用于畜禽支原體疾病、細菌性疾病、螺旋體病和寄生蟲病等的防治,特別是其強烈的抗支原體特性,使其成為治療畜禽支原體疾病的首選藥物;泰樂菌素作為飼料藥物添加劑,廣泛添加于雞、豬、牛等的飼料中,能促進動物生長發(fā)育,提高飼料利用率。在生產(chǎn)實踐中,常使用其鹽類 -酒石酸泰樂菌素和磷酸泰樂菌素[2]。由于泰樂菌素消除半衰期較短,體內(nèi)分布廣泛,常規(guī)劑型酸度大、給藥頻繁,且肌注對局部刺激性較大,易造成動物的應激反應,因而一定程度上限制了它在臨床上的應用效果[3]。

脂質(zhì)體是靶向給藥系統(tǒng)的一種藥物新劑型,該劑型具有靶向、緩釋、低毒、低殘留、無免疫原性等特點,可以包裹水溶性和脂溶性兩類藥物。藥物經(jīng)脂質(zhì)體包載后,可以延長藥物的半衰期,提高治療指數(shù),達到緩控釋及靶向的目的[4]。為改善藥物在體內(nèi)的藥動學特征,提高生物利用度,延長作用時間,減少給藥次數(shù),筆者將磷酸泰樂菌素制成脂質(zhì)體劑型,并以包封率為指標,對脂質(zhì)體的處方組成和工藝進行了優(yōu)化,以期獲得較高的包封率。同時對其理化性質(zhì)及體外釋放行為進行了初步評價。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 RE-2000,上海亞榮生化儀器廠;HZS-H水浴振蕩儀,哈爾濱市東明醫(yī)療儀器廠;數(shù)顯恒溫水浴鍋 HH-2,常州國華電器有限公司;島津 LC-2010C HT高效液相色譜系統(tǒng),島津國際貿(mào)易上海有限公司;D-37520osterode高速冷凍離心機,美國科峻儀器公司;H-6010型透射電子顯微鏡,日本日立公司;Mastersizer 2000型激光散射粒度分析儀,英國 Malvern公司。

1.2 試藥 磷酸泰樂菌素原料藥,西安亨通光華制藥有限公司,效價 830 u/mg;注射用大豆卵磷脂(SPC)成都市科龍化工試劑廠;膽固醇(CH),成都市科龍化工試劑廠;硫酸銨、氯化鈉、磷酸二氫鉀、氫氧化鈉、高氯酸鈉、鹽酸、氯仿、異丙醇,均為分析純;甲醇、乙腈,均為色譜純;自制雙蒸水。

2 方法

2.1 磷酸泰樂菌素脂質(zhì)體的制備

2.1.1 制備方法的篩選 根據(jù)磷酸泰樂菌素的理化性質(zhì),采用不同的方法制備磷酸泰樂菌素脂質(zhì)體,以包封率為指標,篩選最佳制備方法。

2.1.1.1 薄膜分散法(thin film dispersionmethod,TFV) 將 SPC和 CH按質(zhì)量 4∶1的比例混合,加適量氯仿溶解,減壓蒸發(fā),制備磷脂膜后,加入含 2 mg/m L磷酸泰樂菌素的 pH7.0磷酸鹽緩沖液(PBS)水化脂膜,繼續(xù)減壓蒸發(fā)至氯仿完全除盡,即得磷酸泰樂菌素脂質(zhì)體。

2.1.1.2 乙醚注入法(ether injection,EI) 將 SPC和 CH按質(zhì)量比 4∶1的比例混合,加適量乙醚溶解得類脂溶液(油相),將油相緩慢勻速地注入到磁力攪拌的 50℃含 2mg/m L磷酸泰樂菌素的 PBS溶液中,繼續(xù)恒溫攪拌至無乙醚味,即得脂質(zhì)體混懸液。

2.1.1.3 逆相蒸發(fā)法(reverse-phase evaporation method,REV) 將 SPC和 CH按質(zhì)量比 4∶1的比例混合,加適量氯仿溶解(油相),加入含 2 mg/m L磷酸泰樂菌素的 PBS溶液(水相),兩相體積比為3∶1,短時超聲得穩(wěn)定的 W/O型乳劑,減壓蒸發(fā)至瓶壁上形成凝膠,滴加 PBS溶液,繼續(xù)蒸發(fā)除盡氯仿,即得脂質(zhì)體。

2.1.1.4 硫酸銨梯度法(ammonium sulfate gradient method,ASG) 將 SPC和 CH按質(zhì)量比 4∶1的比例混合,加適量氯仿溶解,減壓蒸發(fā),制備磷脂膜后,加入 300mmol/L的硫酸銨溶液水化得到空白脂質(zhì)體。將空白脂質(zhì)體依次通過 0.8μm、0.45μm和 0.22μm的微孔濾膜,進行整粒。整粒后的脂質(zhì)體裝入透析袋中,于0.9%生理鹽水中 37℃恒溫透析 6 h,透析后的脂質(zhì)體中加入含 2 mg/mL磷酸泰樂菌素的 PBS溶液,50℃孵化 20 min,取出即得磷酸泰樂菌素脂質(zhì)體。

2.1.2 單因素考察制備工藝和處方 通過 2.1.1項的比較與篩選,選擇包封率最高的硫酸銨梯度法制備磷酸泰樂菌素脂質(zhì)體。分別考察載藥體系不同 pH值 (5.0,6.0,7.0,8.0)、孵化溫度 (30,40,50,60℃)、孵化時間 (5,10,20,30 min)、藥脂比(1∶2,1 ∶4,1 ∶8,1 ∶10,1 ∶15,1 ∶20)、磷脂與膽固醇質(zhì)量比 (10∶1,8∶1,4∶1,2∶1,1∶1)及硫酸銨濃度(100,200,250,300,400 mmol/L)等對包封率的影響。

2.1.3 正交設計優(yōu)化處方組成 根據(jù)單因素考察結果,選取磷脂與膽固醇之比(A)、藥脂比(B)和硫酸銨濃度(C)3個主要因素,每個因素各擬 3個水平,根據(jù)正交試驗表 L9(34)設計實驗(表 1),以脂質(zhì)體包封率為考察指標,采用硫酸銨梯度法制備脂質(zhì)體,篩選最佳處方組成。

表1 正交實驗的因素和水平

2.2 脂質(zhì)體中磷酸泰樂菌素的含量測定(HPLC)

2.2.1 色譜條件[3,5-6]色譜柱為 KromasilC18柱(4.6mm×150 mm,5μm);流動相為 0.05 mol/L高氯酸鈉溶液 pH(3.0±0.1)-乙腈(65∶35,V/V);柱溫為 30℃;流速為 1.0mL/m in;檢測波長為 290 nm;進樣量為 20℃。理論塔板數(shù)按泰樂菌素 A組分色譜峰計,應不低于 2 000,各雜質(zhì)峰與泰樂菌素 A峰的分離度應符合要求。

2.2.2 標準曲線的制備 精密稱取適量經(jīng) 60℃減壓干燥至恒重的磷酸泰樂菌素精制品,用流動相配成一定濃度的藥物溶液。準確量取上述溶液適量,用流動相配成濃度為 5.0,10.0,20.0,40.0,80.0,160.0,320.0μg/mL的系列溶液,分別進樣測定,記錄峰面積 A,求標準曲線方程。

2.2.3 回收率與精密度試驗 精密吸取一定量空白脂質(zhì)體混懸液,依次準確加入適量濃度為 1 mg/mL的磷酸泰樂菌素標準溶液和異丙醇,用流動相溶解并稀釋成 10.0,80.0,160.0μg/mL三個低、中、高濃度的樣品溶液,分別進樣,記錄峰面積,計算回收率。1 d內(nèi)測定 5次,求得日內(nèi)精密度;1 d 1次,連續(xù)測定 5 d,求得日間精密度。

2.2.4 含量測定 精密吸取磷酸泰樂菌素脂質(zhì)體0.5m L(相當于磷酸泰樂菌素1.0mg),置于 25 mL容量瓶中,加入適量異丙醇破乳,用流動相溶解并稀釋至刻度,進樣分析,記錄峰面積,代入標準曲線方程,計算磷酸泰樂菌素的含量。

2.3 脂質(zhì)體包封率測定 采用低溫高速離心法[7]分離磷酸泰樂菌素脂質(zhì)體和游離藥物,HPLC法測定藥物濃度。精密量取脂質(zhì)體 1 mL于聚丙烯離心管中,4℃,12 000 r/min,離心 45min。準確移取上清液 0.5mL,流動相稀釋至 25mL,進樣測定,記錄峰面積,代入標準曲線計算游離藥物濃度 C游。另取 0.5m L脂質(zhì)體于 25 mL容量瓶中,異丙醇破乳,流動相稀釋并定容,進樣測定,記錄峰面積,代入標準曲線計算總藥物濃度 C總,按下式計算：包封率 =(1-C游/C總)×100%。

2.4 脂質(zhì)體形態(tài)、粒徑及其分布 取脂質(zhì)體混懸液適量,加入 PBS緩沖液稀釋,采用激光散射粒度分析儀測定粒徑及其分布。另取適量脂質(zhì)體混懸液置于銅網(wǎng)上,滴加 2%磷鎢酸溶液負染,自然揮干后,用透射電鏡觀察粒子的形態(tài)。

2.5 體外釋放動力學 采用動態(tài)透析法進行體外釋放實驗[8]。精密移取脂質(zhì)體 2 m L,裝入經(jīng)處理過的透析袋內(nèi),置于 100m L pH 7.0 PBS溶液中,溫度控制在(37±1)℃,轉(zhuǎn)速為 100 r/min。定時吸取透析液 5 m L,并及時補充等量恒溫的 PBS溶液。另取 2 mL脂質(zhì)體于 100m L容量瓶中,加入適量異丙醇破乳,流動相稀釋至刻度,作為總藥量。同時取藥物的 PBS溶液 2 mL于透析袋內(nèi)作為對照。樣品經(jīng)稀釋過濾后,用高效液相色譜法測定藥物濃度,計算累積釋放百分量 Q,繪制累積釋放曲線。

3 結果與討論

3.1 脂質(zhì)體制備方法的篩選 采用不同方法制備磷酸泰樂菌素脂質(zhì)體,其包封率測定結果見表 2。

表2 不同方法制備脂質(zhì)體的包封率測定結果

由結果可知,硫酸銨梯度法制備的脂質(zhì)體包封率明顯高于其他三種方法。根據(jù)藥物裝載機制的不同,脂質(zhì)體的制備可分為被動載藥法和主動載藥法[9-10]。對脂溶性或水溶性好的藥物,被動載藥法如薄膜分散法、逆向蒸發(fā)法、注入法等較為適用;而對于兩親性藥物,其油水分配系數(shù)受介質(zhì) pH和離子強度的影響較大,主動載藥法,如 pH梯度法、硫酸銨梯度法,利用此類藥物能以電中性形式跨越脂質(zhì)雙層,而其電離形式卻不能跨越的原理,通過形成脂質(zhì)體內(nèi)外水相跨膜的離子或化合物梯度,使外水相的藥物自發(fā)地向內(nèi)部聚集,使藥物穩(wěn)定地包封于脂質(zhì)體內(nèi)部,不易泄漏。主動載藥法廣義上是指pH梯度法,硫酸銨梯度法是 pH梯度法的一種,即通過硫酸銨梯度誘導產(chǎn)生 pH梯度,從而實現(xiàn)對弱堿性藥物的包封[11],如磷酸泰樂菌素。因此,最終確定選用硫酸銨梯度法制備磷酸泰樂菌素脂質(zhì)體,以提高包封率和穩(wěn)定性。

3.2 單因素考察結果 采用硫酸銨梯度法制備磷酸泰樂菌素脂質(zhì)體,對制備過程中影響包封率較大的因素進行考察,結果見表 3。

表3 各因素對包封率的影響(n=3)

由表 3可知,pH7.0時包封率最高。在一定pH范圍內(nèi),磷酸泰樂菌素的 logP隨 pH增大而增大,藥物以分子態(tài)存在,更易跨過雙分子層進入內(nèi)水相。超過該 pH,包封率下降,可能與藥物性質(zhì)及磷脂穩(wěn)定性有關。50℃時孵化最完全,載藥最快,5min有 50%以上的藥物進入脂質(zhì)體,20min達到最大值,隨著時間的延長,包封率有下降的趨勢,可能是長時間的作用,使膜流動性增加,部分藥物泄漏。藥脂比為 1∶10時包封率相對最高。投藥量過多,超出了磷脂的承載能力,則無法形成穩(wěn)定合格的脂質(zhì)體。一般而言,藥脂比越小,包封率越大[12]。磷脂與膽固醇質(zhì)量比為 4∶1時,包封率最大。膽固醇量越大,包封率反而下降,甚至很難形成脂質(zhì)體,主要是由于藥物是嵌入雙分子膜之間的,脂質(zhì)量相同時,膽固醇的加入,使膜的剛性增強,曲率、總表面積變小,從而使包封藥量減少[13]。隨著硫酸銨濃度的增大,包封率逐漸升高。濃度越大,間接產(chǎn)生的 pH梯度和驅(qū)動力越大,藥物進入內(nèi)水相的量就越多,包封率也就越高。但是過高的濃度會導致脂質(zhì)體內(nèi)外的滲透壓差過大,在儲存和使用中易引起磷脂膜破裂而導致藥物滲漏,包封率下降[10-11]。

綜合以上實驗結果,確定最佳工藝條件為：載藥時體系 pH為 7.0,孵化溫度為 50℃,孵化時間為20m in。

3.3 正交試驗結果 最佳制備處方為：藥脂比為1∶10,磷脂與膽固醇之比為 4∶1,硫酸銨濃度為 300 mmol/L。極差分析說明,藥脂比對包封率的影響最大。正交試驗結果見表 4。

表4 正交實驗結果

3.4 含量測定方法的考察 HPLC是文獻報道中測定磷酸泰樂菌素含量最普遍的一種方法[5-6,14]。在所選定的色譜條件下,磷酸泰樂菌素各組分峰與輔料及溶劑峰分離良好,磷酸泰樂菌素在 5.0 μg/mL～320.0μg/mL濃度范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關系,回歸方程為 A=9890.364C+2431.2701(r=0.999 9)。高、中、低三個濃度的平均回收率在 99.86%～100.06%之間,日內(nèi) RSD及日間 RSD均小于 2%(n=5),測得藥物平均含量為100.05%。由此可見,該方法可排除輔料及溶劑等的干擾,回收率高,簡單快速,重現(xiàn)性好,結果準確可靠,適合于磷酸泰樂菌素脂質(zhì)體含量及包封率的測定。

圖1 磷酸泰樂菌素脂質(zhì)體透射電鏡照片(80.0×1000)

3.5 脂質(zhì)體的理化性質(zhì) 按最優(yōu)的處方工藝制備的脂質(zhì)體,電鏡下觀察呈球形或類球形,規(guī)則均勻(圖 1)。平均粒徑為 6.526μm,1μm～12μm范圍內(nèi)的粒子占總數(shù)的 90.3%以上(粒度分布見圖 2)。包封率為 58.32%。測定包封率時,通常先將游離藥物與脂質(zhì)體進行分離,常用的分離方法有[15-16]：葡聚糖凝膠過濾法、高速離心法和透析法等。由于所制備的脂質(zhì)體粒徑較大,分子量較高,在 4℃,12 000 r/min,45 min的低溫高速離心條件下,脂質(zhì)體可與游離藥物完全分開,且破壞較少。該方法回收率高,方便快捷,可用于磷酸泰樂菌素脂質(zhì)體包封率的測定。

圖2 磷酸泰樂菌素脂質(zhì)體粒徑分布圖

圖3 磷酸泰樂菌素溶液與脂質(zhì)體的體外釋放動力學曲線(n=3)

表6 磷酸泰樂菌素脂質(zhì)體與溶液動力學方程

3.6 體外釋放結果 磷酸泰樂菌素溶液和磷酸泰樂菌素脂質(zhì)體的累積釋放率見表5,釋放曲線見圖3。

從結果中可以看到,藥物溶液在 8 h內(nèi)已基本釋放完全。而脂質(zhì)體在 8 h時累積釋放率約為51.25%,表現(xiàn)出緩釋作用。將兩者的體外釋藥數(shù)據(jù)分別與零級動力學方程、一級動力學方程、Higuchi方程及 Weibull方程相擬合,結果見表 6。

根據(jù)以上回歸方程及相關系數(shù)可知,r值均大于自由度V=n-2=10,a=0.01時的相關系數(shù)臨界值 r=0.708[17],表明各方程均顯著相關,可用這些方程描述磷酸泰樂菌素脂質(zhì)體的體外釋藥規(guī)律。

結果顯示,磷酸泰樂菌素溶液的體外釋藥過程可用 Higuchi方程描述,8 h內(nèi)藥物已基本釋放完全。而脂質(zhì)體則更好地符合 Weibu ll方程。藥物的釋放可分為前期相對較快和后期相對緩慢的兩個釋藥過程。前期的快速釋藥過程主要是由于脂質(zhì)體外未包封的藥物首先釋放出來,而脂質(zhì)體內(nèi)的藥物要跨過雙分子層才能進入介質(zhì)。脂質(zhì)體作為儲備系統(tǒng),可緩慢釋放藥物。因此,將磷酸泰樂菌素制成脂質(zhì)體劑型,可以獲得較為明顯的緩釋效果。

4 小結

首先采用不同方法制備磷酸泰樂菌素脂質(zhì)體,選擇包封率較高的硫酸銨梯度法作為最終的制備方法。通過單因素考察,正交試驗優(yōu)化得到了最佳的制備工藝和處方,并對其理化性質(zhì)及體外釋放特性進行了考察。按此方法制備的脂質(zhì)體形態(tài)均勻,包封率高,穩(wěn)定性好。藥物經(jīng)脂質(zhì)體裝載后,呈現(xiàn)較為明顯的緩釋作用,為磷酸泰樂菌新制劑的研究提供了劑型參考。

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