于晶晶,王婭娜,于辛酉,師志云,卜 陽(yáng),趙巍

2.寧夏醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院,銀川 750004

細(xì)粒棘球蚴病又稱包蟲(chóng)病,是全球性的人獸共患寄生蟲(chóng)病。在我國(guó)甘肅、寧夏、青海、新疆等西部地區(qū)及相鄰地區(qū)流行〔1〕。根據(jù)幾個(gè)重點(diǎn)流行省區(qū)的不完全統(tǒng)計(jì),估計(jì)我國(guó)受細(xì)粒棘球蚴病威脅的人口約在5 000萬(wàn)人以上,棘球蚴病患者人數(shù)約50-60萬(wàn)人〔2〕。由于包蟲(chóng)病發(fā)病緩慢,易于傳播,并且至今沒(méi)有一種有效的預(yù)防措施,因而嚴(yán)重威脅當(dāng)?shù)厝嗣竦慕】岛托竽翗I(yè)的發(fā)展。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展和廣泛應(yīng)用,極大的推動(dòng)了基因工程疫苗在預(yù)防各種傳染病和寄生蟲(chóng)病的應(yīng)用研究。本研究在已克隆 Eg.zw-5基因的基礎(chǔ)之上〔3〕,構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒,獲取重組蛋白,并對(duì)重組蛋白的免疫學(xué)特性進(jìn)行初步分析。以期為篩選新包蟲(chóng)病疫苗打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒和菌種 zw-5/p GEM-T/JM109〔3〕為本室構(gòu)建。表達(dá)載體pET28a購(gòu)自Novagen公司。大腸埃希菌(Escherichia coli)BL21(DE3)p LysS由Saskatchewan大學(xué)肖偉博士饋贈(zèng)。

1.2 主要試劑儀器 限制性內(nèi)切酶Bam HⅠ、NotⅠ和T4連接酶、IPTG購(gòu)自 PROMEGA公司;酵母提取物、蛋白胨為OXOID公司產(chǎn)品;質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自上海華舜公司;DNA回收試劑盒購(gòu)自北京賽百盛基因技術(shù)有限公司;200bp DNA Marker、Lambda DNA/Hin d IIIMarker、低分子質(zhì)量Marker、預(yù)染Marker、HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG購(gòu)于北京華美生物工程公司;重組蛋白純化試劑盒購(gòu)自Novagen公司;弗氏完全和不完全佐劑購(gòu)自Sigma公司;其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。紫外分光光度儀(DMS200型)美國(guó)Varian公司產(chǎn)品;凝膠成像儀和分析軟件、蛋白質(zhì)電泳及轉(zhuǎn)印裝置、酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀、洗板機(jī)均為BIO-RAD公司產(chǎn)品。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6w齡雌性ICR小鼠,體重(18±2)g,共48只,購(gòu)自寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.4 重組表達(dá)質(zhì)粒Eg.zw-5/p ET28a/BL21(DE3)的構(gòu)建及鑒定 用Bam HⅠ、NotⅠ同時(shí)對(duì)已構(gòu)建的Eg.zw-5/pGEM-T/JM109重組質(zhì)粒和p ET28a進(jìn)行雙酶切,將目的片段與表達(dá)載體p ET28a在T4連接酶的作用下,4。C連接過(guò)夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)菌E.coli BL 21(DE3),并在含有卡那霉素(終濃度為50μg/mL)的YT培養(yǎng)基中,37。C培養(yǎng)過(guò)夜。篩選陽(yáng)性菌落提取質(zhì)粒,用Bam HⅠ和Not I酶切鑒定。將含有重組質(zhì)粒的菌株送大連寶生物有限公司進(jìn)行目的基因測(cè)序、鑒定。

1.5 重組蛋白的表達(dá) 將重組菌接種于含卡那霉素(終濃度為 50μg/mL)的 3mL YT培養(yǎng)基中,37。C,220r/min振蕩培養(yǎng)數(shù) h,按1∶50接種于50mL培養(yǎng)基中,37。C,220r/min,培養(yǎng)至OD600=0.6時(shí),加入IPTG至終濃度為0.4mmol/L,分別25。C、28。C、30。C、37。C振蕩培養(yǎng)過(guò)夜,優(yōu)化誘導(dǎo)表達(dá)條件。4 000r/min離心10min,棄上清,收集細(xì)菌沉淀和誘導(dǎo)表達(dá)前的菌液,進(jìn)行SDS-PAGE鑒定。

1.6 重組zw-5包涵體的鑒定 將37。C誘導(dǎo)表達(dá)收集的菌體,用1×PBS洗三遍后,加入無(wú)變性劑的1×Binding buffer充分重懸。在超聲裂解強(qiáng)度40%的條件下裂菌30min。7 500r/min,4。C離心15min,分別收集上清和沉淀制樣,12%SDS-PAGE鑒定。將超聲裂菌收集的細(xì)菌沉淀按1mL細(xì)菌中加2mL含6mol/L尿素的1×Binding buffer的比例重懸。冰上1h后,12 000r/min,4。C離心30min。收集上清,用0.45μm濾膜過(guò)濾。

1.7 表達(dá)產(chǎn)物的純化 由于Eg.zw-5/his是含6個(gè)his的融合蛋白,可以用Novagen購(gòu)買(mǎi)的含Ni2+的His-bind樹(shù)脂親合層析柱進(jìn)行蛋白的純化。將誘導(dǎo)后的菌液裂解,并收集上清(含尿素)。用樹(shù)脂懸液、1×Charge buffer和 1×Binding buffer含6mol/L尿素處理平衡柱床。將菌液上清加入柱床中,并依次用 1×Binding buffer含 6mol/L尿素、1×Wash buffer含 6mol/L尿素、1×Elut buffer含6mol/L尿素洗脫樹(shù)脂上結(jié)合的蛋白,得到包涵體蛋白。將包涵體蛋白放入透析袋中以去除尿素。SDS-PAGE鑒定純化蛋白,用標(biāo)準(zhǔn)分子量 Marker根據(jù)Bio-Rad公司的Gel Doc1000凝膠分析系統(tǒng)對(duì)蛋白進(jìn)行定量。

1.8 特異性抗血清的制備及重組蛋白的免疫原性鑒定

1.8.1 特異性抗血清的制備(1)小鼠免疫將ICR小鼠隨機(jī)分為4組每組12只。A組:10μg Eg.zw-5/His+佐劑+PBS組;B組:佐劑+PBS對(duì)照組;C組:空白對(duì)照組;(2)免疫方法A、B兩組小鼠在0、2、4w各免疫1次,一共 3次。第1次基礎(chǔ)免疫用弗氏完全佐劑,以后2次為加強(qiáng)免疫均用弗氏不完全佐劑。采用背部皮下多點(diǎn)注射免疫,每次注射量為100μL/只。分別于0、2、4、6、8w 從鼠尾靜脈各采血1次,一共5次。(3)制備抗血清 將血液4 000r/min離心10min,吸取血清,-85。C保存。

1.8.2 蛋白質(zhì)免疫印跡(Western-blot) 特異性血清的免疫識(shí)別粗制Eg.zw-5/His重組抗原、BL21(DE3)p LysS的表達(dá)產(chǎn)物及原頭蚴、囊液、通過(guò)180V電壓SDS-PAGE電泳1h,按常規(guī)方法(電流300mA)印跡轉(zhuǎn)移1h。然后將硝酸纖維膜浸入5%的脫脂奶粉溶液中,37。C封閉2h,以1×PBS-T(含0.5‰Tween-20)洗3次,每次5min。將硝酸纖維膜剪開(kāi)分別浸泡于1∶100稀釋的蛋白免疫的特異性小鼠抗血清及對(duì)照組鼠血清中,4。C過(guò)夜;洗滌后將膜與1∶100稀釋的羊抗鼠IgG-辣根過(guò)氧化物酶(HRP)在 37。C搖床上 60r/min反應(yīng) 2h,再以 1×PBS-T溶液洗4次,每次10min,加入新配制的顯色液(6mg 4-氯-1-奈酚,2mL冷甲醇,10mL 1×TBS,12μLH2O2)顯色 5min,最后用蒸餾水沖洗終止反應(yīng)。

1.8.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA) 用終濃度為10μg/mL的Eg.zw-5/His重組蛋白包被96孔酶標(biāo)板,每孔100μL,4。C過(guò)夜,洗板 4次后,5%脫脂奶粉37。C封閉2h;加入1∶100稀釋的相應(yīng) A、B、C組鼠血清,100μL/孔,37。C孵育 2h,洗板 4次;加入 1∶800稀釋的羊抗鼠IgG-HRP 100μL/孔,37。C孵育2h,洗板4次;加入新配的顯色液(70mL基質(zhì)液,700μL 6mg TMB/1mL DMSO,252μLH 2 O2)顯色20min,用2mol/L H2SO4每孔 50μL終止反應(yīng)。將酶標(biāo)板放入BIO-RAD公司 550型酶標(biāo)儀上測(cè)定450 nm波長(zhǎng)處吸光值(OD值),用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。

2 結(jié) 果

2.1 Eg.zw-5/p ET28a重組表達(dá)質(zhì)粒的酶切鑒定結(jié)果 將構(gòu)建的重組表達(dá)質(zhì)粒Eg.zw-5/p ET28a用限制性內(nèi)切酶Bam H I和Not I雙酶切后,經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)到插入片段大小約624bp,與目的基因片段大小相符(圖1)。

圖1 Eg.zw-5/p ET28a重組表達(dá)質(zhì)粒的酶切鑒定Fig.1 Identification of recombinant zw-5/p ET 28a vetcor

圖2 Eg.zw-5在上清和沉淀的表達(dá)量Fig.2 Eg.zw-5 expression amount in supernatant and sediment

2.2 Eg.zw-5包涵體的鑒定 將菌體裂解液的上清和沉淀分別作SDS-PAGE,考馬斯亮蘭染色后在沉淀中大約28kD位置有一濃染的蛋白條帶,而上清中約28k D處條帶色淺灰。結(jié)果表明:Eg.zw-5在大腸埃希菌中是以包涵體存在的。

2.3 Eg.zw-5/His的純化 經(jīng)IPTG誘導(dǎo),Eg.zw-5/p ET28a基因能在大腸桿菌BL21(DE3)plysS中表達(dá),形成Eg.zw-5/His重組蛋白,并通過(guò)Ni2+的His-bind樹(shù)脂親合層析柱進(jìn)行蛋白的純化,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白的位置可知純化的重組蛋白的分子量約28k D(圖 3)。

圖3 SDS-PAGE鑒定純化重組蛋白Fig.3 Identification of purified reconmbinant protein by SDS-PAGE

2.4 Western-blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果 用抗原免疫的小鼠血清識(shí)別重組蛋白和天然抗原原頭蚴(不能識(shí)別天然抗原囊液),可見(jiàn)在約28k D處有明顯識(shí)別條帶,表明該重組蛋白具有很強(qiáng)的抗原活性,但以上條帶均不被對(duì)照組鼠血清識(shí)別(圖4)。

圖4 重組蛋白免疫鼠血清免疫印跡分析Fig.4 Western-blot analysis with experimental antiserum

2.5 免疫鼠血清抗體水平 分別用蛋白含量為5mg/mL的Eg.zw-5/His,蛋白含量為10mg/mL的囊液和原頭蚴勻漿液包板,用不同組的小鼠血清分別與之結(jié)合反應(yīng),終止反應(yīng)后在酶標(biāo)分析儀上測(cè)定450nm波長(zhǎng)處光吸收值(OD值),用ELISA方法測(cè)定 A、B、C三組 Eg.zw-5免疫鼠血清抗體,經(jīng)SPSS統(tǒng)計(jì)軟件分析,結(jié)果見(jiàn)表1、表2。結(jié)果顯示:免疫前各組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);免疫2w周、4w、6w、8w,A、B組與C組間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。前3次免疫抗體滴度逐漸升高,至第6w抗體滴度達(dá)到最高值,此后逐漸下降。免疫后6w小鼠血清特異性識(shí)別原頭蚴、囊液。原頭蚴包板A組、B組分別與 C組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。囊液包板A組、B組分別與C組比較沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

表1 用重組蛋白包被的ELISA測(cè)定結(jié)果(OD值)Tab.1 ELISA outcome of recombinant antigen

表2 用天然蛋白包被的ELISA測(cè)定結(jié)果(免疫6w血清檢測(cè))Tab.2 ELISE outcomeof natural antigen tested with six antiserum

3 討 論

近年來(lái),利用基因工程技術(shù)發(fā)展包蟲(chóng)疫苗已經(jīng)成為包蟲(chóng)病防治研究的熱點(diǎn)〔4〕,并確定了一些較有希望的候選疫苗分子.現(xiàn)在已經(jīng)篩選出重組Eg.95疫苗并證實(shí)其具有高度、有效的保護(hù)力〔5〕,但由于缺乏更多的疫苗候選分子對(duì)于成蟲(chóng)感染后的免疫機(jī)制方面的研究,包蟲(chóng)病的控制仍然在我國(guó)是一個(gè)重大的醫(yī)學(xué)問(wèn)題。由于包蟲(chóng)生活史復(fù)雜,有多個(gè)發(fā)育階段,抗原成分多,因此廣泛篩選新的候選抗原分子,并用基因重組技術(shù)制備重組抗原(基因工程疫苗),采用多種抗原伍用、針對(duì)多個(gè)發(fā)育階段的多價(jià)復(fù)合疫苗聯(lián)合免疫以增強(qiáng)其免疫效果,是今后包蟲(chóng)疫苗的發(fā)展方向〔7-10〕。本課題組在已研究細(xì)粒棘球蚴P29、HSP70、14-3-3 、鐵蛋白〔11-15〕等的基礎(chǔ)上進(jìn)一步篩選出新的候選抗原分子zw-5,并對(duì)其在細(xì)粒棘球蚴感染的小鼠中做了初步的免疫學(xué)機(jī)制的研究。

經(jīng)DNAman軟件對(duì)本室擴(kuò)增的細(xì)粒棘球蚴zw-5基因序列分析發(fā)現(xiàn),該基因的序列長(zhǎng)度為624bp。在NCBI/BLAST公共數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì) Gen-Bank中檢索的原序列(烏拉圭株)和克隆的中國(guó)大陸株zw-5序列進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn):核苷酸序列的同源性達(dá) 99%〔3〕。Thompson R C A〔6〕研究認(rèn)為細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)在不同地域和不同中間宿主中可發(fā)育成不同的蟲(chóng)株,從而導(dǎo)致其流行病學(xué)特征和致病性不同,同時(shí)由于外在環(huán)境及條件的不同使得寄生蟲(chóng)在長(zhǎng)期的演化過(guò)程中遺傳基因可發(fā)生改變,據(jù)此我們考慮該基因的變化可能因地域差異所造成,是我國(guó)細(xì)粒棘球蚴蟲(chóng)蟲(chóng)株所特有的,因此它作為預(yù)防當(dāng)?shù)匕x(chóng)病疫苗可能具有更好的特異性和針對(duì)性,同時(shí)可能在蟲(chóng)株的鑒別診斷方面也有著一定的應(yīng)用價(jià)值。

鑒于本序列為中國(guó)蟲(chóng)株的特有序列與烏拉圭株的zw-5序列具有差異性,我們已將該基因序列在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行注冊(cè),并獲得GenBank登陸號(hào)為:EU266756。

本次研究在已成功克隆Eg.zw-5基因的基礎(chǔ)上,高效表達(dá)且利用純化的重組蛋白Eg.zw-5/his免疫小鼠獲得抗血清。Western-blot結(jié)果顯示純化的重組蛋白免疫小鼠得到的抗血清,不僅能特異性識(shí)別重組蛋白,也能識(shí)別原頭蚴中相應(yīng)抗原,而對(duì)照組鼠血清均未見(jiàn)反應(yīng)條帶,表明重組蛋白與天然蟲(chóng)體抗原具有共同的抗原表位。用三種不同來(lái)源的蛋白(重組蛋白、天然抗原原頭蚴和囊液)作為抗原包板的ELISA數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示,重組蛋白組血清的抗體IgG含量分別與佐劑+PBS對(duì)照組、空白對(duì)照組血清的抗體IgG含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。免疫后6w小鼠血清特異性識(shí)別原頭蚴、囊液。原頭蚴包板A組、B組分別與C組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。囊液包板A組、B組分別與C組比較沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

兩種實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明,重組抗原具有較好的抗原性和免疫原性,有望成為包蟲(chóng)疫苗的侯選抗原。但重組抗原是否抑制棘球蚴蟲(chóng)的生長(zhǎng)或能否起到殺蟲(chóng)減囊作用,還需進(jìn)一步的動(dòng)物攻擊感染保護(hù)性試驗(yàn)證實(shí)。

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