氣相色譜法測(cè)定帕米膦酸二鈉中的有機(jī)溶劑殘留量

張慧蘭, 喬學(xué)文, 申云飛

(山西康寶生物制品股份有限公司, 長(zhǎng)治 046011)

帕米膦酸二鈉(APD)為新一代雙膦酸鹽類骨代謝改善劑,在對(duì)骨質(zhì)生長(zhǎng)和礦化無(wú)明顯不良影響的劑量下,有很強(qiáng)的抑制骨質(zhì)再吸收作用,國(guó)外已用于惡性腫瘤的高鈣血癥、溶骨性骨轉(zhuǎn)移、佩吉特氏病、骨質(zhì)疏松癥及多發(fā)性骨髓瘤的治療或預(yù)防,對(duì)惡性腫瘤骨轉(zhuǎn)移所引起的疼痛有顯著的止痛作用。帕米膦酸二鈉在碳鏈末端引入氨基,使生物活性大大增強(qiáng),其抑制骨吸收作用比依屈膦酸鈉強(qiáng) 100倍,比氯屈膦酸鈉強(qiáng) 10倍。帕米膦酸二鈉作為骨吸收抑制劑,用于治療腫瘤高血鈣和惡性腫瘤骨轉(zhuǎn)移,療效顯著,副作用低。該藥品 1987年在阿根廷首先上市后,在英、美以及歐洲國(guó)家普遍相繼上市使用。由于該藥在合成過程中使用了有機(jī)溶劑甲醇、氯苯,本研究采用氣相色譜法,以 50%N,N-二甲基甲酰胺為溶劑,對(duì)帕米膦酸二鈉中甲醇、氯苯溶劑殘留量進(jìn)行測(cè)定,操作簡(jiǎn)單,重現(xiàn)性好,可用于該原料藥中甲醇、氯苯殘留的測(cè)定。

1 儀器與試藥

島津 GC-14C型氣相色譜儀;FID檢測(cè)器。帕米膦酸二鈉原料藥(山西康寶生物制品股份有限公司生產(chǎn),批號(hào) 040401,040402,040403),甲醇、氯苯、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn) 色譜柱 DIMWax毛細(xì)管柱(30 m×0.32 mm,0.50μm);進(jìn)樣口溫度為240℃;FID檢測(cè)器,溫度為250℃;柱溫 40℃(保持 5 min),以 20℃/min升溫至 180℃(保持1 min);載氣為氮?dú)?進(jìn)樣量 1μl。在此色譜條件下,理論板數(shù)以氯苯計(jì)算為5 354,氣相色譜圖見圖1,甲醇、氯苯及溶劑 N,N-二甲基甲酰胺的保留時(shí)間約為0.975,5.305,7.772 min,分離度均＞4?？瞻兹軇?N,N-二甲基甲酰胺對(duì)測(cè)定不干擾。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的配制 精密稱取甲醇(15.6 mg)、氯苯(14.5 mg)分別置 25 ml量瓶中,加 50%N,N-二甲基甲酰胺稀釋至刻度,搖勻,作為殘留溶劑對(duì)照品儲(chǔ)備液,再分別精密量取甲醇對(duì)照品貯備液 5.0 ml和氯苯對(duì)照品貯備液 0.6 ml于 10 ml量瓶中,加 50%N,N-二甲基甲酰胺稀釋至刻度,搖勻,作為對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的配制 精密稱取供試品 1.0 g于具塞試管中,精密加入 10 ml 50%DMF溶解,濾過,取續(xù)濾液,即得。

2.3 精密度試驗(yàn) 取 2.2項(xiàng)下對(duì)照品溶液,平行進(jìn)樣 5次,測(cè)得甲醇、氯苯峰面積的RSD分別為1.53%和1.08%。

2.4 檢測(cè)限 分別取甲醇、氯苯對(duì)照品儲(chǔ)備液稀釋制成一定濃度的溶液,進(jìn)樣 1μl,當(dāng)甲醇、氯苯濃度分別為0.374μg/ml,0.209μg/ml,信噪比約為3,甲醇、氯苯的檢測(cè)限分別為0.4 ng,0.2 ng。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 分別精密量取甲醇對(duì)照品儲(chǔ)備液 1.0,2.5,5.0,6.5,8.0 ml和氯苯對(duì)照品儲(chǔ)備液 0.2,0.4,0.6,0.8,1.0 ml,分別置 10 ml量瓶中,用 50%N,N-二甲基甲酰胺配制成每毫升含甲醇 62.4,156.0,312.0,405.6,499.2μg和氯苯 11.6,23.2,34.8,46.4,58.0μg的標(biāo)準(zhǔn)溶液。照上述色譜條件進(jìn)樣 1μl,記錄色譜圖,以峰面積(A)對(duì)濃度(C)進(jìn)行線性回歸。甲醇 Y=304.87X-7 982.2,r=0.999 2;氯苯 Y=2 727.6X-17 465,r=0.999 4。甲醇和氯苯分別在 62.4-499.2 mg/ml和11.6-58.0 mg/ml的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.6 回收率試驗(yàn) 取本品(批號(hào) 040401)6份,每份約 1.0 g,置 10 ml量瓶中,再精密加入 2.2項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量(低、中、高樣品,使甲醇和氯苯濃度分別約為249.6,312.0,374.4μg/ml和27.84,34.80,41.76μg/ml),加 50%N,N-二甲基甲酰胺溶解,并定容至刻度,搖勻。依上述色譜條件,精密量取 1μl進(jìn)樣,并記錄色譜圖,計(jì)算回收率及 RSD值,結(jié)果見表1,2。

圖1 2種有機(jī)溶劑及空白溶劑氣相色譜圖Fig 1 Gas chromatograms of blank(A)and two organic solvents(B)

表1 甲醇回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab 1 Recovery test of methanol

表2 氯苯回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab 2 Recovery test of chlorobenzene

2.7 測(cè)定結(jié)果 取標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品溶液與供試三批樣品溶液,進(jìn)樣 1μl,進(jìn)行色譜分析,測(cè)定結(jié)果見表3。

表3 帕米膦酸二鈉有機(jī)溶劑殘留量的測(cè)定結(jié)果Tab 3 Contents of residual solvents in pamidronate disodium

3 討論

3.1 限度的確定 人用藥物注冊(cè)技術(shù)要求國(guó)際協(xié)調(diào)會(huì)(ICH)的有機(jī)溶劑殘留量指導(dǎo)原則中,規(guī)定甲醇和氯苯為第二類應(yīng)該限制使用的溶劑,本文參照中國(guó)藥典 2005年版二部的指標(biāo)要求,規(guī)定待測(cè)溶劑的限度為:甲醇 0.3%,氯苯 0.036%。

3.2 溶劑的選擇 由于帕米膦酸二鈉為水溶性藥物,而待測(cè)的有機(jī)溶劑氯苯在水中的溶解性不好,故選擇 50%N,N-二甲基甲酰胺水溶液做溶劑,這樣不僅可以使帕米膦酸二鈉充分溶解,還可以使氯苯在 N,N-二甲基甲酰胺充分溶解。

3.3 柱溫的選擇 本實(shí)驗(yàn)采用程序升溫的方法,測(cè)定時(shí)將柱溫設(shè)定在 40℃保持 5 min,使甲醇和氯苯能很好分離,但溶劑 N,N-二甲基甲酰胺沸點(diǎn)高,故以 20℃/min升溫至 180℃,加快 N,N-二甲基甲酰胺出峰。

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