邢冬紅 趙謹瑩 肖振霞 李會強 白 虹

人絨毛膜促性腺激素（hCG）是妊娠期間由胎盤滋養(yǎng)層細胞分泌的一種糖蛋白激素。除了具有刺激黃體分泌孕酮以維持妊娠的功能外，hCG還具有一定的免疫調(diào)節(jié)功能。巨噬細胞移動抑制因子（MIF）屬于促炎癥細胞因子，它是一個多效性分子，有很多分子參與并介導其功能的表達。目前已知MIF參與多種生理生化過程，如：炎癥、免疫應答、細胞增殖、血管生成和腫瘤形成等過程[1]。但有關(guān)MIF在妊娠期間的合成、分泌、分布以及功能表達還鮮有報道。hCG影響多種細胞因子的轉(zhuǎn)錄和表達[2]。本文利用熒光定量PCR方法，探討hCG對外周血單核細胞（PBMC）中MIF mRNA轉(zhuǎn)錄的影響，為闡明hCG對細胞因子調(diào)節(jié)作用的機制，解釋hCG在生理及某些病理過程中的調(diào)節(jié)作用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 于2007年1月采自天津市血液中心健康獻血者新鮮外周血，用淋巴細胞分離液（購自中國醫(yī)學科學院血液病學研究所）分離獲得人PBMC，細胞計數(shù)后懸浮于含15%小牛血清RPMI 1640（Gibco）的培養(yǎng)液中。ABI 7000熒光定量PCR 儀（ABI公司，美國），重組hCG（r-hCG）（10 000 U/mL）購自天津鼎天生物技術(shù)有限公司,細胞培養(yǎng)液RPMI 1640（Gibco公司），細菌脂多糖（LPS）購自Sigma公司，反轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)試劑盒（PROMEGA公司，美國），熒光定量PCR試劑盒（TaKaRa生物工程有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 引物的設計與合成 MIF引物：上游5′-GCCCGGACAG GGTCTACA-3′，下游 3′-CTTAGGCGAAGGTGGAGTTGTT-5′；合成產(chǎn)物322 bp。β-actin 引物：上游 5′-CCCAAGGCCAA CCGCGAGAAGAT-3′，下游 3′-GTCCCGGCCAGCCAGGTCCA G-5′；合成產(chǎn)物219 bp。均由上海生工生物技術(shù)服務有限公司設計并合成。

1.2.2 人PBMC的分離 參考文獻[3]分離人PBMC。

1.2.3 不同濃度r-hCG對MIF mRNA轉(zhuǎn)錄的影響 將上述PBMC懸液分成5組，每組分別加入100 IU/mL、10 IU/mL、1 IU/mL、0.1 IU/mL和0 IU/mL的r-hCG，每組3孔，每孔細胞濃度1×106/mL，每孔再加入2 μg/mL LPS激活細胞，混勻后于37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)2 h，取出后1 500 r/min離心10 min，并提取沉淀細胞RNA。

1.2.4 r-hCG作用不同時間對MIFmRNA轉(zhuǎn)錄的影響 將上述PBMC懸液分成7組，每組3孔，每孔1 mL含1×106細胞，每孔分別加入 LPS(2 μg/mL)和 r-hCG(100 IU/mL)刺激細胞，混勻后 37 ℃，5%CO2條件下培養(yǎng)，分別于 0、0.5、1、2、4、8、16 h收獲細胞并提取RNA。

1.2.5 RNA提取 嚴格按試劑盒說明書進行。提取的RNA經(jīng)電泳證實呈現(xiàn)兩條清晰銳利的18 S和28 S條帶，紫外分光光度計測定其260/280 nm比值為1.7～2.0。

1.2.6 逆轉(zhuǎn)錄（RT）合成cDNA 逆轉(zhuǎn)錄體系總體積20 μL：總RNA1 μL，dNTP（10 mmol）2 μL，AMV1 μL，Oligo dT（2.5×10－6mol/L）1 μL，RNA 酶抑制劑 0.5 μL，MgCl2（25 mmol）4 μL，10×Buffer2 μL，去 RNA 酶水 8.5 μL.RT 條件為 55 ℃30 min，99℃ 5 min，5℃ 5 min。保存cDNA于－20℃ 冰箱，以備后續(xù)熒光定量PCR用。

1.2.7 熒光定量PCR檢測 PBMC中MIF mRNA轉(zhuǎn)錄水平按試劑盒說明書配制25 μL PCR擴增反應體系：12.5 μL SYBR Green 混合物（×2），0.2 μL cDNA，1 μL 引物混合物（5 ×10-6mol/L），11.3 μL H2O。PCR 反應條件：50 ℃ 2 min,95 ℃10 min，95℃15s，60℃30s，72℃30s，40個循環(huán)后再以 72℃10 min，1循環(huán)。反應結(jié)束后，采用ABI prism 7000 sds熒光定量PCR分析系統(tǒng)分析裂解曲線。

1.3 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 15.0統(tǒng)計軟件分析所得數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（±s）表示，數(shù)據(jù)用t檢驗進行分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度r-hCG對LPS誘導人PBMC中MIF mRNA轉(zhuǎn)錄的影響 在實驗濃度范圍內(nèi)，含有一定濃度r-hCG的實驗組與不含r-hCG的對照組相比，MIF mRNA的轉(zhuǎn)錄水平差異有統(tǒng)計學意義（均P<0.05），見表1。 擬合回歸方程Y贊=e(1.005+0.669x)，（Y贊：MIF/β-actin，x：r-hCG 濃度）。

2.2 100 IU/mL r-hCG作用不同時間對LPS誘導人PBMC中MIF mRNA轉(zhuǎn)錄的影響 在100 IU/mL的r-hCG作用下，在刺激后2 h后，MIF基因轉(zhuǎn)錄水平達到峰值，與對照組差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。隨后MIF的mRNA水平開始回落，到第8h和第16h時，MIF基因轉(zhuǎn)錄水平基本回到刺激前的水平，與對照組差異無統(tǒng)計學意義，見表2。擬合回歸方程x：時間）。

表1 不同濃度r-hCG對PBMC中MIFmRNA轉(zhuǎn)錄的影響（n＝3，±s）

表1 不同濃度r-hCG對PBMC中MIFmRNA轉(zhuǎn)錄的影響（n＝3，±s）

*P＜0.05

組別統(tǒng)計學處理r-hCG(IU/ml) MIF/β-actin 組比t LPS①LPS+r-hCG②LPS+r-hCG③LPS+r-hCG④LPS+r-hCG⑤--0.1 1.0 10 100 0.82±0.15 1.13±0.17 2.90±0.40 3.45±0.40 4.92±0.36①∶②①∶③①∶④①∶⑤2.60 7.03*14.35*24.23*

表2 100 IU/mL r-hCG作用不同時間對PBMC中MIF mRNA轉(zhuǎn)錄的影響 （n＝3，±s）

表2 100 IU/mL r-hCG作用不同時間對PBMC中MIF mRNA轉(zhuǎn)錄的影響 （n＝3，±s）

*P＜0.05

r-hCG作用時間(h)統(tǒng)計學處理MIF/β-actin 組比t 0①0.5②1③2④4⑤8⑥16⑦0.70±0.11 7.83±1.30 12.28±1.62 12.40±0.45 7.00±0.41 1.01±0.21 0.67±0.14①∶②①∶③①∶④①∶⑤①∶⑥①∶⑦9.47*12.08*38.95*20.93*1.68 0.31

3 討論

MIF是一個由115個氨基酸殘基組成的分子質(zhì)量為12.5 ku的蛋白，屬于炎癥誘發(fā)細胞因子，可直接抑制巨噬細胞的移動，參與多種生理生化過程。已有研究發(fā)現(xiàn)，MIF參與了整個妊娠過程，且hCG可以誘導和調(diào)控MIF的表達和分泌[4]。如Akoum等[5]報道hCG可以誘導子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞合成并分泌MIF，懷孕前3個月，子宮內(nèi)膜細胞及滋養(yǎng)層細胞都能表達MIF。表明在植入期及胚胎發(fā)育早期，該因子起了某種作用。hCG并沒有影響MIF mRNA在細胞中的穩(wěn)定性，而主要是通過提高MIF基因的轉(zhuǎn)錄水平來發(fā)揮作用。由于MIF可以促進早期血管形成并參與免疫修飾，并且有抑制自然殺傷細胞（NK）活化等特性，可能在胚胎植入及生長發(fā)育的過程中，MIF作為一種可引起子宮內(nèi)膜變化的重要影響因子的細胞介導物，并受hCG誘導。而hCG作為人類激素中碳水化合物含量最高的糖蛋白激素，其主要生物學活性是刺激母體黃體分泌孕酮，在維持早期妊娠中發(fā)揮著重要作用。正常妊娠時，胚胎種植后第1天即可在母體血清中檢測到hCG，至妊娠的60～90 d hCG血清水平達高峰，于妊娠中期降至較低水平。研究發(fā)現(xiàn)，不僅hCG，妊娠早期婦女的PBMC也有促進黃體分泌孕酮的作用[6]，提示PBMC在妊娠早期的內(nèi)分泌系統(tǒng)中具有重要作用。本實驗將不同劑量的hCG作用于體外培養(yǎng)的PBMC，發(fā)現(xiàn)一定劑量的hCG可逐漸增加PBMC產(chǎn)生MIF。采用RT-PCR方法分析PBMC中MIF mRNA的轉(zhuǎn)錄水平，發(fā)現(xiàn)hCG對MIF表達的調(diào)控是發(fā)生在基因轉(zhuǎn)錄水平上的，且在一定濃度范圍內(nèi)與hCG的濃度呈正相關(guān)。另外，筆者進行了hCG作用不同時間對PBMC中MIF mRNA轉(zhuǎn)錄水平的影響實驗，發(fā)現(xiàn)在一定濃度hCG的作用下，hCG在很短時間內(nèi)即可增強MIF基因轉(zhuǎn)錄水平，在1～2 h就可達到峰值，隨后開始回落，在第8小時基本回到刺激前的水平，表明hCG對MIF的調(diào)控是一種短時的效應。hCG可能是通過調(diào)控MIF的表達而參與巨噬細胞趨化及炎癥反應，但MIF是否在hCG誘導下參與了妊娠的發(fā)生和發(fā)展，還有待于進一步研究。

[1]Nishihira J.Macrophage migration inhibitory factor(MIF):its essential role in the immune system and cell growth[J].J Interferon Cytokine Res,2000,20(9):751-762.

[2]Davies S,Byrn F,Cole LA.Human chorionic gonadotropin testing for early pregnancy viability and complications[J].Clin Lab Med,2003,23(2):257-264.

[3]張玉環(huán)，陳保疆，焦振山,等.特應性皮炎患者單個核細胞Th1/Th2和IFN-γ及IL-4 mRNA表達[J].天津醫(yī)藥,2006,34(12):833-835.

[4]Wada S,Kudo T,Kudo M,et al.Induction of macrophage migration inhibitory factor in human ovary by human chorionic gonadotrophin[J].Hum Reprod,1999,14(2):395-399.

[5]Akoum A,Metz CN,Morin M.Marked increase in macrophage migration inhibitory factor synthesis and secretion in human endometrial cells in response to human chorionic gonadotropin hormone[J].J Clin Endocrinol Metab,2005,90(5):2904-2910.

[6]Nakayama T,Fujiwara H,Maeda M,et al.Human peripheral blood mononuclear cells (PBMC)in early pregnancy promote embryo invasion in vitro:HCG enhances the effects of PBMC[J].Hum Reprod,2002,17(1):207-212.