呂愛民 柳 嘯
(湖北省監(jiān)利市監(jiān)利中學(xué) 湖北荊州 433300)
近幾年高考試題和模擬題中出現(xiàn)了大量與引物有關(guān)的試題,而現(xiàn)有高中生物學(xué)教材只提及PCR 技術(shù)需要引物。為什么需要引物?引物是什么?引物的作用是什么?引物的堿基序列如何設(shè)計?PCR 循環(huán)時需要多少引物?如何選擇引物和判斷引物的互補鏈?引物與PCR 反應(yīng)時復(fù)性溫度的高低和時間長短有什么關(guān)系?這些相關(guān)問題在教材中并未提及,需要教師對上述相關(guān)問題進行歸類分析。
筆者在基因工程專題的復(fù)習(xí)過程中構(gòu)建了以引物為核心的知識網(wǎng)絡(luò)圖(圖1),培養(yǎng)學(xué)生學(xué)科內(nèi)知識的綜合能力,拓展學(xué)生視野,提高學(xué)生的科學(xué)素養(yǎng)。各個擊破相關(guān)知識點,夯實學(xué)生的基礎(chǔ),加深對引物的理解。利用精選的典型試題,強化鞏固知識,提升學(xué)生的解題能力。同時從側(cè)面為教師的教學(xué)提供參考,提升對教學(xué)廣度和深度的把控。
圖1 “引物”知識網(wǎng)絡(luò)圖
1.1 DNA 的復(fù)制需要引物 DNA 聚合酶只能催化脫氧核糖核苷酸加至已有核酸鏈的游離3′-羥基上,而不能使脫氧核糖核苷酸自身發(fā)生聚合,即它需要引物鏈的存在[1]。引物是一小段DNA 或RNA,它能與DNA 母鏈的一段堿基互補配對。細胞內(nèi)DNA 復(fù)制以RNA 作引物,從新合成的岡崎片段上發(fā)現(xiàn)含有一短暫存在的小的RNA 片段附著在5′端這一事實,可說明DNA 復(fù)制時需要RNA引物,這些引物長5~10 bp,現(xiàn)已知RNA 引物的合成是由一種特殊的RNA 合成酶——引物酶所催化的[2]。PCR 反應(yīng)以DNA 作引物。
例1(2011年江蘇卷),請回答基因工程方面的有關(guān)問題:PCR 反應(yīng)體系中含有熱穩(wěn)定DNA 聚合酶,下面的表達式(圖2)不能正確反映DNA 聚合酶的功能,這是因為_____。
圖2 DNA 聚合酶催化的反應(yīng)的表達式
答案:DNA 聚合酶不能從頭開始合成DNA,而只能將單個脫氧核苷酸連續(xù)結(jié)合至雙鏈DNA片段的引物鏈上。
1.2 引物的作用 DNA 聚合酶不能從頭開始合成DNA,只能從3′端延伸DNA 鏈。當(dāng)引物與DNA母鏈通過堿基互補配對結(jié)合后,DNA 聚合酶就能從引物的3′端開始延伸DNA 鏈。不同的引物可結(jié)合不同的目的基因并進行擴增。
例2,請回答基因工程方面的有關(guān)問題:
1)若用PCR 技術(shù)擴增psy基因和crtI基因,需要分別在不同的PCR 擴增儀中加入__種引物,其作用是________。
2)在利用PCR 技術(shù)擴增R(抗旱)或r基因過程中,利用___可尋找抗旱基因的位置并進行擴增。
答案:1)2;引物與DNA 模板鏈通過堿基互補配對結(jié)合,使DNA 聚合酶從引物的3′端開始連接脫氧核苷酸,從而延伸DNA 子鏈;2)引物。
例3,為研究水稻D基因的功能,研究者將TDNA 插入到D基因中(圖3),致使該基因失活,失活后的基因記為d。為驗證F2植株基因型(DD、Dd和dd),研究者根據(jù)D基因、T-DNA 的序列,設(shè)計了3 種引物,如圖4所示。
圖3 將T-DNA 插入到D 基因
圖4 3 種引物的堿基序列
隨機選取F2植株若干,提取各植株的總DNA,分別用引物“Ⅰ+Ⅲ”組合及“Ⅱ+Ⅲ”組合進行PCR,檢測是否擴增(完整的T-DNA 過大,不能完成PCR)。
如果引物“Ⅰ+Ⅲ”組及“Ⅱ+Ⅲ”組進行PCR均可完成擴增,則相應(yīng)植株的基因型為__。
如果_______,則相應(yīng)植株的基因型為__。
如果_______,則相應(yīng)植株的基因型為__。
答案:Dd;僅引物“Ⅰ+Ⅲ”組進行PCR 能完成擴增,而“Ⅱ+Ⅲ”組不能完成擴增;dd;僅引物“Ⅱ+Ⅲ”組進行PCR 能完成擴增,而“Ⅰ+Ⅲ”組不能完成擴增;DD。
2.1 設(shè)計引物的原則 引物是根據(jù)目的基因特有的一段已知的核苷酸序列設(shè)計合成的,能與目的基因的模板鏈通過堿基互補配對特異性地結(jié)合。
設(shè)計引物的主要原則為[1]:①引物長度應(yīng)大于16 個核苷酸,可防止隨機結(jié)合;②引物與靶序列間的Tm不應(yīng)過低;③引物不應(yīng)有發(fā)夾結(jié)構(gòu),即不能有4 bp 以上的回文序列;④2 個引物間不應(yīng)有4 bp 以上的互補序列或同源序列,在3′端不應(yīng)有任何互補的堿基;⑤引物中堿基的分布盡可能均勻,G+C 含量接近50%。
例4,請回答基因工程方面的有關(guān)問題:
1)通過PCR 技術(shù)可在DNA 分子中專一性擴增出某目的基因,其原因是______。
2)(2011年江蘇卷)請回答基因工程方面的有關(guān)問題:設(shè)計引物是PCR 技術(shù)關(guān)鍵步驟之一。某同學(xué)設(shè)計的2組引物(圖5)都不合理,請分別說明理由。
圖5 設(shè)計的2組引物部分堿基序列
①第1 組:_____;②第2 組:_____。
3)科研過程中,可用PCR 技術(shù)檢測受體細胞是否成功轉(zhuǎn)入了目的基因。提取轉(zhuǎn)染后的細胞的全部DNA 分子,用目的基因的引物擴增。擴增完畢后,檢測發(fā)現(xiàn)擴增產(chǎn)物中除目的基因外,還有其他不同大小片段的非目的基因片段,可能的原因一般有______。
①模板受到污染;②退火溫度過高;③引物太短;④延伸溫度偏低。
答案:1)引物是根據(jù)目的基因的一段已知核苷酸序列設(shè)計合成的(或引物能與目的基因通過堿基互補配對結(jié)合);2)第1 組:引物Ⅰ和引物Ⅱ局部發(fā)生堿基互補配對而失效;第2 組:引物Ⅰ′自身折疊后會出現(xiàn)局部堿基互補配對而失效;3)①③。
2.2 引物的處理 由于引物延伸從3′端開始,3′端不能進行任何修飾,引物5′端對擴增特異性影響不大,因此,可給予修飾而不影響擴增特異性。引物5′端修飾包括加酶切位點、標(biāo)記生物素、熒光等[3]。為了使經(jīng)PCR 擴增的目的基因能與運載體正常結(jié)合,需要在2種引物的5′端添加不同的限制酶的識別序列。在2種引物的5′端上添加不同的限制酶識別序列,是為了保證目的基因定向插入運載體并可避免目的基因自身環(huán)化。
例5(2018年江蘇卷),為生產(chǎn)具有特定性能的α-淀粉酶,研究人員從某種海洋細菌中克隆了α-淀粉酶基因(1 656 個堿基對),利用基因工程大量制備α-淀粉酶。為了便于擴增的DNA 片段與表達載體連接,需在引物的____端加上限制性酶切位點,且常在2 條引物上設(shè)計加入不同的限制性酶切位點,主要目的是_________。
答案:5′;使DNA 片段能定向插入表達載體,減少自連。
2.3 引物的特點 綜合2.1 和2.2 可知,引物具有以下幾個特點:①引物能與DNA 模板通過堿基互補配對結(jié)合;②2種引物之間不能互補配對;③某一引物不能自身折疊出現(xiàn)局部堿基互補配對;④需要在2 種引物的5′端添加不同的限制酶的識別序列;⑤引物不能太短。
PCR 的原理是DNA 分子的半保留復(fù)制,所以要根據(jù)DNA 分子的2 條模板鏈設(shè)計2 種引物。PCR 循環(huán)時需要的引物數(shù)量的計算有2種方法。
方法1:第n次循環(huán)產(chǎn)生的DNA 數(shù)為2n,根據(jù)DNA 分子的半保留復(fù)制可知,需要的引物數(shù)為2n個,從第1 次循環(huán)開始,需要引物的個數(shù)依次為2 個、22個、23個……2n個,故PCR 過程經(jīng)過n次循環(huán),需要的引物總個數(shù)是2+22+23+……+2n=2n+1-2。
方法2:PCR 經(jīng)過n次循環(huán)產(chǎn)生的DNA 數(shù)為2n,一共有2n+1條鏈,其中有2條鏈是DNA 母鏈,不含引物,其他的每1 條鏈均含1 個引物,并且2 種引物的數(shù)量相等,故PCR 過程經(jīng)過n次循環(huán),需要的引物總個數(shù)是2n+1-2,需要某一種引物的總個數(shù)是(2n+1-2)×1/2=2n-1。2n個DNA 中,一個DNA 由1 條母鏈和第1 種引物延伸的子鏈組成,另一個DNA 由另一條母鏈和第2 種引物延伸的子鏈組成,其他的DNA 均由2 種引物延伸的2 條子鏈組成。
例6,通過PCR 方法獲得某目的基因,首先需要設(shè)計______(填“一對”或“一個”)引物,PCR 過程經(jīng)過4 次循環(huán),第4 次循環(huán)時需要的引物的數(shù)量是__個,4次循環(huán)一共需要的引物的總數(shù)量是____個。
答案:一對;16;30。
例7(2011年江蘇卷),請回答基因工程方面的有關(guān)問題:利用PCR 技術(shù)擴增目的基因,其原理與細胞內(nèi)DNA 復(fù)制類似(圖6)。圖中引物為單鏈DNA 片段,它是子鏈合成延伸的基礎(chǔ)。
圖6 PCR 的原理示意圖
①從理論上推測,第4 輪循環(huán)產(chǎn)物中含有引物A 的DNA 片段所占的比例為____。
②在第___輪循環(huán)產(chǎn)物中開始出現(xiàn)兩條脫氧核苷酸鏈等長的DNA 片段。
答案:①15/16;②三。
DNA 聚合酶只能特異性地復(fù)制處于2 個引物之間的DNA 序列,引物5′端的堿基與DNA 母鏈3′端的堿基進行堿基互補配對,可作為DNA 復(fù)制的起始點,DNA 子鏈的合成方向是從引物的5′端向3′端延伸。可利用這一特點判斷引物及引物的互補鏈。
例8(2016年江蘇卷),為了篩選出轉(zhuǎn)入了重組質(zhì)粒的大腸桿菌,應(yīng)在篩選平板培養(yǎng)基中添加四環(huán)素,平板上長出的菌落,常用PCR 鑒定,所用的引物組成為圖7中的。
圖7 引物組成圖
答案:引物甲和引物丙。
例9,下圖是為了擴增某目的基因所用引物的分布示意圖(圖8),已知引物組合1 和2、3 和4可擴增相關(guān)的目的基因,則引物1、3 與___(填α鏈或β 鏈)形成堿基互補配對關(guān)系。
圖8 引物的分布示意圖
答案:β鏈。
PCR 的每次循環(huán)可分為變性(90~95℃)、復(fù)性(55~60℃)和延伸(70~75℃)3 步。變性的溫度與目的基因中G+C 含量有關(guān);變性時間的長短與目的基因的長短有關(guān),目的基因越長,變性的時間就越長。復(fù)性是讓2 種引物通過堿基互補配對與2 條單鏈DNA 結(jié)合,復(fù)性的溫度與引物中G+C 含量有關(guān),G-C 堿基對間有3 個氫鍵,A-T 堿基對間只有2 個氫鍵,引物中G+C 含量較高,復(fù)性時溫度就較高;復(fù)性時間的長短與引物的長短有關(guān),引物越長,復(fù)性的時間就越長。延伸的溫度不能太高,以防止新合成的子鏈DNA 與母鏈DNA 解聚為單鏈,延伸的溫度也不能太低,是為了保證Taq 酶的活性;延伸所需要的時間長短與目的基因的長短有關(guān),目的基因越長,延伸所需要的時間就越長。
例10(2008年江蘇卷),將動物致病菌的抗原基因?qū)腭R鈴薯制成植物疫苗,飼喂轉(zhuǎn)基因馬鈴薯可使動物獲得免疫力。以下是與植物疫苗制備過程相關(guān)的圖和表。PCR 過程中退火(復(fù)性)溫度必須根據(jù)引物的堿基數(shù)量和種類設(shè)定。表1為根據(jù)模板設(shè)計的2 對引物序列,圖9為引物對與模板結(jié)合示意圖。請判斷哪一對引物可采用較高的退火溫度?__________。
表1 引物對序列表
圖9 引物對與模板結(jié)合示意圖
答案:引物對B。
例11,請回答PCR 擴增時與退火溫度、延伸溫度與延伸時間有關(guān)的問題:
1)(2018年江蘇卷)進行PCR 擴增時,反應(yīng)的溫度和時間需根據(jù)具體情況進行設(shè)定,下列選項中___的設(shè)定與引物有關(guān),___的設(shè)定與擴增片段的長度有關(guān)。(填序號)
①變性溫度;②退火溫度;③延伸溫度;④變性時間;⑤退火時間;⑥延伸時間。
2)(2017年江蘇卷)PCR 擴增時,退火溫度的設(shè)定是成敗的關(guān)鍵。退火溫度過高會破壞___的堿基配對。退火溫度的設(shè)定與引物長度、堿基組成有關(guān),長度相同但___的引物需要設(shè)定更高的退火溫度。
3)(2017年江蘇卷)如果PCR 反應(yīng)得不到任何擴增產(chǎn)物,可采取的改進措施有___(填序號)。
①升高退火溫度;②降低退火溫度;③重新設(shè)計引物。
4)(2021年湖北省元月聯(lián)考)通過PCR 方法獲得eGFP 目的片段,首先需要設(shè)計___(填“一對”或“一個”)引物,在體外選擇性擴增eGFP 目的片段。PCR 反應(yīng)一般由95℃熱變性、55~60℃引物和模板配對、72℃延伸3個步驟,經(jīng)過多次循環(huán)完成。延伸階段選用72℃是綜合考慮了2個因素,這2 個因素是_____和_____。
答案:1)②;⑥;2)引物與模板;GC 含量高;3)②③;4)一對;防止DNA 變性;保證Taq 酶所需溫度條件。
提高能力應(yīng)以落實基礎(chǔ)知識為前提,上述典型例題圍繞引物的相關(guān)知識點以考查基礎(chǔ)知識為首要目標(biāo),落實對基本概念的理解,例如,引物應(yīng)該成對存在、引物5′端與DNA 母鏈3′端堿基互補配對、DNA 子鏈只能從引物的3′端開始延伸等;同時對引物的設(shè)計與處理、與引物相關(guān)的計算及PCR 反應(yīng)時復(fù)性溫度的高低和時間長短等知識點,又可考查學(xué)生的科學(xué)思維和運用知識的能力?!癙CR 反應(yīng)得不到任何擴增產(chǎn)物”或“擴增產(chǎn)物中除目的基因外還有其他不同大小片段的非目的基因片段”引導(dǎo)學(xué)生關(guān)注引物在PCR 技術(shù)中的應(yīng)用并學(xué)會解決科學(xué)研究中遇到的問題。教師應(yīng)該在落實基礎(chǔ)知識的同時重視對引物的歸納整理,重視教學(xué)提升,鍛煉學(xué)生的思維,跳出考題。教師應(yīng)該重視滲透科學(xué)、技術(shù)、社會相互關(guān)系的教育,通過具體事例幫助學(xué)生認識生物學(xué)與社會發(fā)展的緊密聯(lián)系[4]。引導(dǎo)學(xué)生關(guān)注科學(xué)知識在生活、生產(chǎn)技術(shù)中的應(yīng)用,努力將學(xué)生培養(yǎng)成創(chuàng)新型的人才。