陳敏，蔣予箭，沈忱，張海珍

(浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，浙江杭州，310035)

低鹽固態(tài)醬油淋澆發(fā)酵工藝優(yōu)化*

陳敏，蔣予箭，沈忱，張海珍

(浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，浙江杭州，310035)

以豆粕、麩皮為原料，對(duì)低鹽固態(tài)醬油淋澆發(fā)酵工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。以一淋原油中氨基酸態(tài)氮含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，開展了發(fā)酵溫度、鹽水濃度和淋澆周期單因素試驗(yàn)。在此基礎(chǔ)上，采用Box-Benhnken響應(yīng)面分析法，設(shè)計(jì)了3因素3水平試驗(yàn)，通過SAS軟件分析得到回歸模型并進(jìn)行了方差分析，優(yōu)化的工藝參數(shù)為:發(fā)酵溫度43.1℃，鹽水濃度為14.8°Bè，淋澆周期為2.5 d/次。在此工藝下一淋原油中氨態(tài)氮含量達(dá)到11.4 g/L，與回歸模型的預(yù)測(cè)值相對(duì)誤差僅0.88%，回歸方程與實(shí)際情況擬合較好。

醬油，低鹽固態(tài)發(fā)酵，淋澆，氨態(tài)氮，響應(yīng)面法

醬油是以大豆、小麥、麩皮等為原料經(jīng)過米曲霉制曲，拌鹽水發(fā)酵釀制成的糧油深加工品，現(xiàn)行的生產(chǎn)工藝主要包括低鹽固態(tài)發(fā)酵工藝和高鹽稀態(tài)發(fā)酵工藝2種。低鹽固態(tài)發(fā)酵工藝因設(shè)備投資低、生產(chǎn)周期短等特點(diǎn)，目前主導(dǎo)著中低端醬油產(chǎn)品的生產(chǎn)。但與高鹽稀態(tài)發(fā)酵工藝相比，產(chǎn)品風(fēng)味稍欠缺，如何提高低鹽固態(tài)釀造醬油的風(fēng)味是行業(yè)十分關(guān)注的課題［1］。淋澆發(fā)酵是采用重復(fù)將發(fā)酵池底的醬汁回淋于醬醅面層，可達(dá)到改善醬油風(fēng)味，提高醬油得率及品質(zhì)的目的［2－4］。近年來，一些醬油生產(chǎn)企業(yè)先后注意到了淋澆發(fā)酵工藝在提高低鹽固態(tài)醬油出品率及改善醬油品質(zhì)方面的作用，開始進(jìn)行生產(chǎn)性試驗(yàn)或應(yīng)用。但由于對(duì)具體工藝參數(shù)的認(rèn)識(shí)及控制上的差異，應(yīng)用效果差異很大。因而開展低鹽固態(tài)醬油淋澆工藝的系統(tǒng)研究，將對(duì)醬油生產(chǎn)企業(yè)起到指導(dǎo)作用。

本試驗(yàn)以淋澆發(fā)酵釀造醬油一淋原油中氨基酸態(tài)氮(ammoniacal acids content，AN，簡(jiǎn)稱氨態(tài)氮)的含量作為考察低鹽固態(tài)釀造醬油淋澆發(fā)酵工藝的主要指標(biāo)。在淋澆發(fā)酵溫度、鹽水濃度和淋澆周期單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用Box-Benhnken響應(yīng)面分析法，設(shè)計(jì)了3因素3水平試驗(yàn)，通過SAS軟件分析得到回歸模型并進(jìn)行了方差分析和驗(yàn)證試驗(yàn)，進(jìn)行了低鹽固態(tài)醬油淋澆發(fā)酵工藝參數(shù)的優(yōu)化。

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

豆粕、麩皮、食鹽，杭州食品釀造有限公司提供。

滬釀3.042米曲霉，上海迪發(fā)釀造生物制品有限公司。

PDA培養(yǎng)基，杭州微生物試劑有限公司。

VS－840－2超凈工作臺(tái)，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;YXQ-LS-SⅡ全自動(dòng)電熱壓力蒸汽滅菌器，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;PHS-3C Precise pH METER酸度計(jì)，上海雷磁儀器廠;78HW－1恒溫磁力攪拌器，杭州儀表電機(jī)廠;76－1玻璃恒溫水浴缸，常州國(guó)華電器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

滬釀3.042米曲霉菌種活化:取保存的菌種，接種于馬鈴薯－葡萄糖液體培養(yǎng)基上，28℃，轉(zhuǎn)速150 r/min，培養(yǎng)時(shí)間 72 h。

種曲制備:m(豆粕)∶m(麩皮)∶m(水)=1∶4∶5，121℃滅菌20 min，冷卻后以0.3%量接入活化菌種，30℃，轉(zhuǎn)速150 r/min，培養(yǎng)時(shí)間72 h。

成曲制備:m(豆粕)∶m(麩皮)∶m(水)=6∶4∶5，121℃滅菌20 min，冷卻后以0.3%量接入種曲，在33～35℃下通風(fēng)培養(yǎng)39 h出曲。

入池發(fā)酵:根據(jù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)配制不同濃度的鹽水，m(鹽水)∶m(成曲)=1∶1.5 混合均勻，發(fā)酵 20 d，跟蹤測(cè)定氨態(tài)氮含量。

淋油:發(fā)酵結(jié)束時(shí)，每缸加入同體積80℃的熱水。浸沒固態(tài)醬醅表面，靜置12 h后抽提出一淋原油;再加入同體積熱水浸沒固態(tài)醬醅表面，靜置4 h后抽提出二油。同時(shí)進(jìn)行氨態(tài)氮、全氮、蛋白質(zhì)利用率指標(biāo)的測(cè)定。

氨態(tài)氮測(cè)定方法:甲醛滴定法［5］。

全氮測(cè)定方法:凱氏定氮法［6］。

蛋白質(zhì)利用率計(jì)算:

蛋白質(zhì)利用率/%=

式中:m、d、ρN，本次產(chǎn)醬油的實(shí)際量、密度、全氮含量;m1、d1、ρn1，借用上次二淋油的量、密度、全氮含量;m2、d2、ρN2，本次產(chǎn)的二淋油的量、密度、全氮含量;mp，混合原料中蛋白質(zhì)的總量，kg。

1.3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)［7－10］

通過單因素試驗(yàn)結(jié)果，確定發(fā)酵溫度(X1)、鹽水濃度(X2)、淋澆周期(X3)3個(gè)因素與氨態(tài)氮含量進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)(表2)，采用SAS8.0對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析。每一自變量的低、中、高試驗(yàn)水平分別以－1、0、+1進(jìn)行編碼，該模型通過最小二乘法擬合二次多項(xiàng)方程 Y =A0+ΣAiXi+ΣAiiXi2+ΣAijXiXj，其中 Y 為響應(yīng)值(氨態(tài)氮含量) ，A0、Ai、Aii、Aij為方程系數(shù)，Xi、Xj(i≠j)為自變量編碼值。多項(xiàng)式模型方程擬合的性質(zhì)由確定系數(shù)R2表達(dá)，顯著性采用F檢驗(yàn);采用SAS典型性分析預(yù)測(cè)最大氨態(tài)氮含量的發(fā)酵條件。

2 結(jié)果與討論

2.1 兩種低鹽固態(tài)醬油發(fā)酵工藝的比較

在 m(成曲)∶m(鹽水)=1∶1.5，鹽水濃度為 15°Bè，發(fā)酵溫度42～45℃條件下，分別采用低鹽固態(tài)發(fā)酵工藝與低鹽固態(tài)淋澆發(fā)酵工藝，以玻璃恒溫水浴缸進(jìn)行保溫發(fā)酵，共發(fā)酵5批次。分析對(duì)照2種工藝條件下釀造醬油的氨態(tài)氮指標(biāo)與蛋白質(zhì)利用率，結(jié)果如表1。

表1 兩種工藝條件所得醬油理化指標(biāo)的比較

表1表明，2種工藝下醬油一淋原油氨態(tài)氮含量差異顯著，原料蛋白質(zhì)利用率差異極顯著。淋澆工藝下，醬油一淋原油的氨態(tài)氮含量和原料蛋白質(zhì)利用率均比對(duì)照組高，氨態(tài)氮含量較對(duì)照組提高21%，蛋白質(zhì)利用率比對(duì)照組提高13.7%?？梢?，采用淋澆工藝改善低鹽固態(tài)釀造醬油的質(zhì)量、提高工廠經(jīng)濟(jì)效益的效果是明顯的。

2.2 淋澆發(fā)酵工藝參數(shù)的單因素試驗(yàn)

2.2.1 發(fā)酵溫度的優(yōu)化

發(fā)酵溫度與醬醅中蛋白質(zhì)的水解速度和水解程度密切相關(guān)，還會(huì)影響雜菌的生長(zhǎng)情況，在較低溫度下進(jìn)行發(fā)酵，容易使醬醅酸敗。試驗(yàn)考察了33、38、43、48和53℃對(duì)淋澆醬油一淋原油氨態(tài)氮的影響，見圖1。由圖1可見，發(fā)酵溫度為43℃，有利于蛋白質(zhì)的分解，氨態(tài)氮含量最高。

圖1 發(fā)酵溫度對(duì)醬油中氨態(tài)氮含量的影響

2.2.2 鹽水濃度的優(yōu)化

向成曲拌入鹽水的主要作用是防止發(fā)酵過程醬醅的雜菌污染，但過高的鹽水濃度會(huì)抑制蛋白酶的作用，使得發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)。本試驗(yàn)考察了9、12、15、18、21°Bè鹽水對(duì)淋澆醬油一淋原油AN的影響，結(jié)果見圖2。試驗(yàn)結(jié)果表明，鹽水濃度在15°Bè時(shí)一淋原油中的AN含量最高，在該鹽水濃度下成曲中蛋白質(zhì)分解最好，氨態(tài)氮形成最高。

圖2 不同鹽水濃度對(duì)醬油氨態(tài)氮含量的影響

2.2.3 淋澆發(fā)酵周期的優(yōu)化

淋澆的目的主要是:(1)使醬醅保持在濕潤(rùn)的狀態(tài)，(2)使醬醅溫度保持均勻。對(duì)于不淋澆的低鹽固態(tài)發(fā)酵工藝，上層醬醅到了發(fā)酵后期常由于水分過低，蛋白質(zhì)水解不充分，原料利用率偏低。本試驗(yàn)考察了1、2、3、4、5 d的淋澆周期對(duì)一淋醬油中氨態(tài)氮的影響。試驗(yàn)結(jié)果表明，淋澆周期為2 d時(shí)，醬油的氨態(tài)氮含量較高，質(zhì)量較好。同時(shí)試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，由于低鹽固態(tài)淋澆發(fā)酵工藝醬醅表面沒有覆面鹽，若淋澆周期＞3 d，醬醅表面容易長(zhǎng)出白色的霉?fàn)钗铩?/p>

圖3 不同淋澆周期對(duì)醬油氨態(tài)氮含量的影響

3 響應(yīng)面法對(duì)淋澆發(fā)酵工藝條件進(jìn)行優(yōu)化

3.1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素與水平

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取單因素試驗(yàn)的最優(yōu)點(diǎn)為中心，采用響應(yīng)曲面法中的Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)研究?jī)?yōu)化低鹽固態(tài)醬油淋澆工藝。根據(jù)Box中心組合設(shè)計(jì)原理，設(shè)計(jì)了3因素3水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)。共有15個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，其中12個(gè)為析因子，3個(gè)為0點(diǎn)，以估計(jì)誤差。以氨態(tài)氮含量為響應(yīng)值(Y)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2和表3。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素與水平

表3 響應(yīng)面中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

3.2 回歸模型的建立和方差分析

運(yùn)用SAS軟件對(duì)響應(yīng)值進(jìn)行回歸分析，經(jīng)擬合得到回歸預(yù)測(cè)模型為:

Y=1.139 867 －0.002 988 X1－0.006 163 X2+0.302 00 X3－0.046 021 X12－0.025 975 X2X1－0.084 521 X22+0.007 050 X3X1－0.011 700 X3X2－0.031 546 X32，回歸方程的方差分析見表4和表5。

表4 回歸方程的方差分析

表5 回歸系數(shù)取值及分析結(jié)果

從表3和表4可看出，該回歸方程的一次項(xiàng)顯著，二次項(xiàng)非常顯著，說明各個(gè)試驗(yàn)因素對(duì)響應(yīng)值的影響是二次拋物線的關(guān)系。整體模型的“Prob＞F”值小于0.05，表明該二次方程模型比較顯著;R2=0.943 8，說明這種試驗(yàn)方法是可靠的，能夠很好地描述試驗(yàn)結(jié)果，使用該方程進(jìn)行真實(shí)的試驗(yàn)點(diǎn)分析是可行的?；貧w系數(shù)顯著性檢驗(yàn)表明，在所選取的各因素水平范圍內(nèi)，對(duì)低鹽固態(tài)一淋原油氨態(tài)氮影響的排序依次為:鹽水濃度＞發(fā)酵溫度＞淋澆周期。

3.3 響應(yīng)曲面圖分析

根據(jù)回歸結(jié)果作出相應(yīng)曲面圖，結(jié)果見圖4～圖6。

圖4是在鹽水濃度處于中心點(diǎn)(15°Bè)時(shí)，其他2因素的交互作用體現(xiàn)。由圖4可知，同一發(fā)酵溫度下，氨態(tài)氮含量隨著淋澆周期的延長(zhǎng)呈先增加后減少的趨勢(shì)。原因是適當(dāng)?shù)牧軡仓芷谟欣谥魄鷷r(shí)產(chǎn)生的蛋白酶與底物的充分接觸，還可促進(jìn)空氣中耐鹽酵母和乳酸菌在醬醅中的生長(zhǎng)繁殖，改善醬油風(fēng)味。若淋澆周期過長(zhǎng)，醬醅中蛋白質(zhì)分解速度減緩，醬油風(fēng)味變差;而淋澆周期過短，會(huì)導(dǎo)致雜菌增殖過快，消耗醬醅中已分解的原料，導(dǎo)致一淋原油氨態(tài)氮偏低。

圖5是在淋澆周期處于中心點(diǎn)(2 d/次)時(shí)，其它2因素的交互作用體現(xiàn)。由圖5可知隨著發(fā)酵溫度的增加，氨態(tài)氮含量在45℃附近時(shí)達(dá)到最高值，且回歸方程中發(fā)酵溫度和鹽水濃度的一次項(xiàng)和二次項(xiàng)均顯著(P＜0.05)。說明發(fā)酵溫度與鹽水濃度的交互作用顯著。

圖6是在發(fā)酵溫度處于中心點(diǎn)(45℃)時(shí)，其他2因素的交互作用體現(xiàn)。由圖6可知，同一淋澆周期時(shí)，氨態(tài)氮含量隨著鹽水濃度的增加呈先增加后減少的趨勢(shì)。分析原因應(yīng)是鹽水濃度較低，雜菌生長(zhǎng)較容易，消耗醬醅中蛋白質(zhì)物質(zhì)，導(dǎo)致一淋原油中氨態(tài)氮偏低。若鹽水濃度偏高，雖較好抑制了雜菌的生長(zhǎng)，但不利于醬渣中蛋白酶的催化，延緩了原料的分解利用，在相同的發(fā)酵時(shí)間內(nèi)，氨態(tài)氮含量達(dá)不到較高的水平。

3.4 發(fā)酵工藝條件的確定與驗(yàn)證

通過軟件分析，低鹽固態(tài)淋澆發(fā)酵工藝的最佳參數(shù)為發(fā)酵溫度43.2℃，鹽水濃度為14.8°Bè，淋澆周期2.5 d/次。在此工藝條件下氨態(tài)氮含量的理論值是1.15 g/100 mL。為檢驗(yàn)響應(yīng)面法的可靠性，采用上述發(fā)酵參數(shù)作3組平行驗(yàn)證試驗(yàn)，實(shí)際測(cè)得值為(1.14±0.006 7)g/100 mL，理論值與實(shí)際值的相對(duì)誤差在0.88%左右，差異不顯著。因此，采用響應(yīng)面法優(yōu)化得到的低鹽固態(tài)醬油的淋澆工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠，具有實(shí)用價(jià)值。

圖4 溫度與淋澆周期交互影響氨態(tài)氮含量的曲面圖

圖5 溫度與鹽水濃度交互影響氨態(tài)氮含量的曲面圖

圖6 鹽水濃度與淋澆周期交互影響氨態(tài)氮含量的曲面圖

4 結(jié)論

通過單因素試驗(yàn)確定了影響低鹽固態(tài)醬油淋澆工藝一淋原油氨態(tài)氮的各因素水平范圍，采用Box-Behnken 3因素3水平試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化因素水平，應(yīng)用SAS軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，得出以醬油一淋原油氨態(tài)氮為指標(biāo)的最優(yōu)的淋澆工藝參數(shù)，即發(fā)酵溫度43.2℃，鹽水濃度為 14.7°Bè，淋澆周期 2.5 d/次。經(jīng)過驗(yàn)證試驗(yàn)，實(shí)際測(cè)得的一淋原油中氨態(tài)氮含量平均為 11.4 g/L，與理論預(yù)測(cè)值的相對(duì)誤差僅為0.88%左右，因此，采用響應(yīng)面法優(yōu)化得到的方程能較好的模擬試驗(yàn)結(jié)果，優(yōu)化得到的淋澆工藝參數(shù)具有較強(qiáng)的應(yīng)用價(jià)值。

［1］ 林祖申.提高低鹽固態(tài)發(fā)酵醬油質(zhì)量風(fēng)味的研究與探討［J］.中國(guó)釀造，2001(6):1－4.

［2］ 謝韓.探討醬油生產(chǎn)的淋澆工藝［J］ .江蘇調(diào)味副食品，2004，21(4):20 －21.

［3］ 張海珍，蔣予箭，陳敏，等.淋澆工藝對(duì)低鹽固態(tài)釀造醬油風(fēng)味的影響［J］.中國(guó)調(diào)味品，2009(8):91－94.

［4］ Reeta Rani Singhania，Anil Kumar Patel，Carlos R Soccol，et al.Recent advances in solid-state fermentation［J］.Biochemical Engineering Journal，2009，44:13 －18.

［5］ ZB X 66014－1987.低鹽固態(tài)發(fā)酵醬油檢驗(yàn)方法［S］.

［6］ GB/T 5009.5－2003.食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定［S］.

［7］ 張鐘，劉正，李鳳霞.用響應(yīng)面法優(yōu)化黑糯玉米發(fā)酵乳飲料發(fā)酵工藝參數(shù)［J］.中國(guó)糧油學(xué)報(bào)，2008，23(1):160－164.

［8］ Cheng Jin，Li Q S，Xiao Ru-cheng.A new artificial neural network-based response surface method for structural reliability analysis［J］.Probabilistic Engineering Mechanics，2008，23:51 －63.

［9］ 李云雁，胡傳榮.試驗(yàn)設(shè)計(jì)與數(shù)據(jù)處理［M］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2005:3－64.

［10］ 洪楠，侯軍.SAS for windous(v8)統(tǒng)計(jì)分析系統(tǒng)教程新編［M］.北京:清華大學(xué)出版社，北京交通大學(xué)出版社，2004:159－284.

Optimization of Spraying Extraction Process Parameters for Soy Sauce Under Low Salt and Solid State Fermentation Using Response Surface Methodology

Chen Min，Jiang Yu-jian，Shen Chen，Zhang Hai-zhen
(College of Food Science and Bioengineering，Zhejiang Gongshang University，Hangzhou 310035，China)

In this paper，the process parameters of low-salt and solid-state fermentation with Spraying-extraction were investigated by using soybean，bran as raw material.The variation range of parameters was determined by single factor experiment.Then three factors such as temperature，concentration of brine and spraying-extraction cycle were optimized by response surface method.Using amino acids contents as the response value，the effects of various factors were estimated through variance analysis and response surface analysis.The results showed that optimum fermentation temperature，concentration of brine and spraying-extraction cycle were 43.1℃，14.8°Bè，2.5 days，respectively.Under these conditions，the amino acids content of soy sauce was 1.14g/100 mL.The experimental values agree with those predicted from the regression model within a relative error of 0.88%，indicating a good fitness.

soy sauce，low-salt and solid-state fermentation，spraying-extraction，amino acids contents，response surface methodology

碩士，副教授。

*浙江省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2007C22001)

2010－03－19，改回日期:2010－06－21