丹酚酸C誘導肝癌HepG2細胞有絲分裂阻滯及凋亡的研究

楊 華，程金建，梁 鋼

丹參是治療心腦血管疾病的常用中藥之一，有著悠久的臨床應用歷史。其水溶性有效成分主要是多種酚酸類化合物，包括丹酚酸A、B、C、D等。目前對丹參水溶性成分的研究取得了一定成就，發(fā)現(xiàn)丹酚酸類化合物具有多方面的藥理作用［1－2］。遺憾的是，大部分研究都集中于總丹酚酸、丹酚酸A、丹酚酸B等化學成分，而對其它有效單體的研究較少。從化學結(jié)構(gòu)來看，丹酚酸既有咖啡酰縮酚酸結(jié)構(gòu)又有新木脂素骨架。新木脂素是一類廣泛存在于多種高等植物的天然產(chǎn)物，具有廣泛的藥理活性，包括抗腫瘤、抗氧化、抗炎及免疫調(diào)節(jié)、鎮(zhèn)痛以及心血管方面的活性［3－4］，其中抗腫瘤活性一直是新木脂素藥理作用研究的熱點，小檗科鬼臼屬植物中的鬼臼毒素類木脂素及其半合成衍生物VP-16(etoposide)和VM-26(teniposide)已開發(fā)成為抗腫瘤藥物應用于臨床［5］。丹參水溶性成分中的丹酚酸 C(salvianolic acid C，Sal C)是具有2-芳基苯并呋喃結(jié)構(gòu)的新木脂素，研究顯示，許多天然或合成的苯并呋喃類新木脂素化合物具有良好的抗腫瘤活性。從中藥花椒中提取到的2-芳基苯并呋喃化合物ailanthoidol，對乳腺癌細胞 MCF-7有抗增殖作用［6］，云南擬單性木蘭中分離得到的3個苯并呋喃類木脂素，對人腫瘤細胞株HCT-8、SIHa及GLC-82具有明顯的生長抑制作用［7］。Pieters等［8］合成了一系列苯并呋喃類化合物，體外實驗表明，這些化合物對60種人腫瘤細胞均有不同程度的細胞毒作用。另有研究報道［9］，合成的一系列苯并呋喃類化合物具有明顯的抑制腫瘤血管生成作用。本研究旨在檢測丹酚酸C對人腫瘤細胞的增殖抑制作用以及對HepG2細胞周期和凋亡的影響，并探索相關的機制。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑 丹酚酸C購自上海滬云醫(yī)藥開發(fā)有限公司，為黃色粉末，純度 ＞98%，用生理鹽水溶解。秋水仙堿為Calbiochem公司產(chǎn)品，微管蛋白聚合活性檢測試劑購自Cytoskeleton公司，Caspase活性檢測試劑盒為南京凱基生物科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品。

1.2 細胞培養(yǎng)與實驗分組 人肝癌細胞株HepG2、人宮頸癌細胞株HeLa、人結(jié)腸癌細胞株HT29、人肺癌細胞株A549、人鼻咽癌細胞株CNE2和人白血病細胞株HL-60均用含體積分數(shù)0.10小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液置37℃、5%CO2孵育箱培養(yǎng)。實驗均在細胞對數(shù)生長期進行，分別設溶劑對照(Control)組和 5、10、20 μmol·L－1丹酚酸 C 組。

1.3 方法

1.3.1 MTT法檢測丹酚酸C的抗增殖作用 取對數(shù)生長期細胞接種于96孔板，貼壁后加入不同濃度的丹酚酸C，每個濃度設4個平行孔，培養(yǎng)72 h后加入MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去培養(yǎng)液，加入150 μl二甲基亞砜，振蕩10 min，用酶標儀測定570/630 nm雙波長吸光度(A)值，以Bliss法計算半數(shù)抑制濃度(IC50)。

1.3.2 流式細胞術檢測細胞周期及細胞凋亡 分別收集不同時間、不同濃度丹酚酸C處理的HepG2細胞，PBS洗滌兩次，用體積分數(shù)為0.70的乙醇固定過夜。棄去乙醇，再次懸浮細胞于PBS，溴化丙啶染色5 min，4℃避光30 min。在流式細胞儀上檢測細胞DNA含量，得出細胞分布圖以及凋亡細胞所占比例。LYSIS軟件分析。

1.3.3 Giemsa染色觀察有絲分裂阻滯 丹酚酸C處理HepG2細胞24 h后，離心收集細胞，加入細胞固定液固定，滴片于載玻片上，晾干后將載玻片置于Giemsa染液中浸染，顯微鏡下觀察。處于有絲分裂期(M期)的細胞核膜消失，染色質(zhì)松散分布于胞質(zhì)。隨機計數(shù)200個細胞，計算M期細胞所占的比例，即有絲分裂指數(shù)(MD)。

1.3.4 微管蛋白聚合活性測定 按試劑說明用General Tubulin Buffer溶解微管蛋白粉末并置冰浴，微管蛋白溶液分為溶劑對照組、不同劑量丹酚酸C組和秋水仙素陽性對照組，分別加入相應藥物后，混合溶液加入冰浴的比色杯中，紫外分光光度計340 nm下調(diào)零;隨后將比色杯置37℃恒溫水浴保溫，每5 min測定一次吸光度(A)值，直到40～45 min A值無明顯上升時止;以時間(min)為橫坐標，A值(A340nm)為縱坐標，繪制各組微管蛋白聚合曲線，取各組在45 min時的A值，計算藥物對微管蛋白聚合的抑制率:抑制率/%=(A對照－A加藥)/A對照×100%。

1.3.5 Caspase-3和 Caspase-6活性檢測 按Caspase活性檢測試劑盒說明，收集不同濃度丹酚酸C處理的HepG2細胞5×106個，加入Lysis Buffer冰上裂解20 min，離心收集上清，加入反應緩沖液和Caspase底物(Caspase-3底物為 DEVD-pNA，Caspase-6底物為IEVD-pNA)，37℃避光孵育4 h，酶標儀測定405 nm波長處的吸光度值(A405nm)。

1.4 統(tǒng)計學分析 采用SPSS12.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學處理，數(shù)據(jù)以±s表示。細胞周期分析、有絲分裂指數(shù)測定和Caspase活性檢測的實驗組和對照組均采用非參數(shù)Kruskal-Wallis檢驗，微管蛋白聚合活性檢測實驗組和對照組采用Friedman秩和檢驗。實驗結(jié)果至少重復3次。

2 結(jié)果

2.1 丹酚酸C體外抗腫瘤細胞增殖作用 丹酚酸C對HepG2等細胞的生長抑制作用結(jié)果見Tab 1。由表可知，肝癌細胞HepG2對丹酚酸C比較敏感，鼻咽癌細胞CNE2和白血病細胞HL-60對丹酚酸C的敏感性相對較差。

Tab 1 Inhibitory effect of Sal C on the proliferation of human tumor cell lines(±s，n=6)

Tab 1 Inhibitory effect of Sal C on the proliferation of human tumor cell lines(±s，n=6)

Cell type Cell line IC50/μmol·L －1 Hepatocellular cancer HepG2 22.6 ±1.3 Cervical cancer HeLa 26.8 ±1.7 Colorectal cancer HT29 29.3 ±1.9 Lung cancer A549 36.2 ±2.6 Nasopharyngeal cancer CNE2 44.7 ±2.2 Leukemia HL-60 57.3 ±2.8

2.2 丹酚酸C對HepG2細胞周期分布和凋亡的影響 流式細胞儀分析顯示，不同劑量的丹酚酸C分別作用HepG2細胞24 h后，細胞出現(xiàn)不同程度的G2/M期阻滯(P＜0.05):對照組細胞G2/M期比例為 0.160 ± 0.031，5、10、20 μmol·L－1丹酚酸 C 組G2/M期細胞比例分別為0.253±0.028、0.388±0.032、0.440 ±0.053，見 Fig 1;細胞凋亡率呈劑量依賴性和時間依賴性上升，見Tab 2。

Fig 1 Effect of Sal C on cell cycle distribution of HepG2 cellsA:Control;B，C and D:5，10 and 20 μmol·L －1Sal C group

Tab 2 Induction of apoptosis by Sal C in HepG2 cells( ± s，n=4)

Tab 2 Induction of apoptosis by Sal C in HepG2 cells( ± s，n=4)

*P＜0.05 vs control

C/μmol·L －1Apoptotic cells/%24 h 48 h 72 h Control 0.5 ±0.1 2.9 ±0.8 4.9 ±1.3 5 7.2 ±1.2* 23.8 ±2.5* 47.4 ±6.3*10 8.2 ±1.8* 39.6 ±5.6* 56.9 ±7.1*20 15.1 ±1.9* 44.0 ±6.1* 58.6 ±7.7*

2.3 丹酚酸C誘導細胞有絲分裂阻滯 Giemsa染色結(jié)果顯示，不同劑量丹酚酸C分別處理HepG2細胞24 h后，細胞呈現(xiàn)不同程度的有絲分裂阻滯。處于有絲分裂期(M期)的細胞核膜消失，染色體深染且松散分布于胞質(zhì)中(Fig 2 B，C，D)，間期細胞核膜完整，胞核呈圓形或橢圓形，染色均勻(Fig 2 A)。隨機計數(shù)200個細胞，計算其中有絲分裂期細胞所占的比例即有絲分裂指數(shù)(MD)，對照組的有絲分裂指數(shù)為0.032 ±0.008，5、10、20 μmol·L－1丹酚酸C組的有絲分裂指數(shù)分別為0.108±0.017、0.337±0.021、0.263±0.015，丹酚酸C使有絲分裂指數(shù)明顯提高(P＜0.05)。

Fig 2 Mitotic blockade by Sal C in HepG2 cells(×300)A:Control cells;B，C and D:5，10 and 20 μmol·L －1Sal C-treated cells

2.4 丹酚酸C對微管蛋白聚合活性的影響 微管蛋白溶液在0～4℃是無色透明溶液，在37℃保溫時，微管蛋白逐漸聚合成微管，溶液在340 nm的吸光度(A值)逐漸上升，并在一定時間內(nèi)達到坪值。根據(jù)測得的A值對保溫時間作圖，可以繪制出特征性的“S”型聚合曲線。干擾微管蛋白聚合的藥物可以使曲線形態(tài)發(fā)生改變，曲線坪值也隨之發(fā)生變化。實驗結(jié)果顯示，隨著37℃保溫時間的延長，溶劑對照組A值經(jīng)過短暫的潛伏期(5 min)后開始逐漸升高，在45 min時基本達到坪值;陽性對照秋水仙素組A值在整個保溫過程中有輕微上升，其曲線坪值明顯低于對照組(P＜0.05)，對微管蛋白聚合的抑制率為 0.656;5、10、20 μmol·L－1丹酚酸 C 組的曲線坪值與對照組比較有不同程度的降低(P＜0.05)，對微管蛋白聚合的抑制率分別為0.259、0.567 和0.600，見 Fig 3。

2.5 丹酚酸 C對 HepG2細胞 Caspase-3和Caspase-6活性的影響 不同劑量丹酚酸C分別處理 HepG2細胞 48 h后，細胞中 Caspase-3和Caspase-6的活性均明顯升高，與對照組比較差異具有顯著性(P ＜ 0.05)。5、10、20 μmol·L－1用藥組Caspase-3活性分別是對照組的4.1倍、5.2倍、5.6倍，Caspase-6活性分別是對照組的3.0倍、3.8倍、4.1倍，見 Fig 4。

Fig 3 Inhibitory effect of Sal C on tubulin polymerization

Fig 4 Increased activities of Caspase-3 and Caspase-6 in HepG2 cells treated with Sal C±s，n=4)*P＜0.05 vs control

3 討論

中藥的活性成分結(jié)構(gòu)新穎，安全性高，不良反應少，從中藥中開發(fā)新的抗腫瘤藥物具有極大的潛力。許多研究表明，丹參水溶性成分具有抗腫瘤作用，Liu等［10］報道，丹參的水溶性提取物能明顯抑制人肝癌細胞株HepG2的增殖并引起細胞形態(tài)的改變，最終導致細胞凋亡;沈云婕 等［11］發(fā)現(xiàn)，注射用丹參多酚酸鹽可抑制人肺腺癌SPC-A-1細胞、人肝癌SMMC-7721細胞、B淋巴瘤Raji細胞和白血病HL-60細胞的生長并誘導凋亡。上述報道多以丹參水溶性成分的混合物為研究對象，本研究發(fā)現(xiàn)丹參水溶性單體成分丹酚酸C對人肝癌HepG2細胞有較明顯的增殖抑制作用，這與上述研究報道具有互補性。

流式細胞儀分析顯示，丹酚酸C作用細胞24 h即可誘導明顯的G2/M期阻滯。由于流式細胞儀不能區(qū)分處于G2期和M期的細胞，故進行Giemsa染色觀察細胞的有絲分裂情況，正常情況下，細胞的有絲分裂指數(shù)為0.03～0.05，而丹酚酸C使HepG2細胞的有絲分裂指數(shù)升高至0.337，提示發(fā)生有絲分裂阻滯。在有絲分裂期(M期)，為了保證遺傳物質(zhì)平均分配到兩個子代細胞，姐妹染色單體的著絲點必須與紡錘體兩極發(fā)出的紡錘體微管相結(jié)合，才能實現(xiàn)染色單體的分離。紡錘體在細胞進入M期時由胞質(zhì)中的微管蛋白聚合而成，若紡錘體裝置出現(xiàn)異常，姐妹染色單體就不能正確分離和移動，從而發(fā)生M期阻滯［12］。作用于微管蛋白的化合物能夠引起M期紡錘體微管結(jié)構(gòu)損傷，使細胞阻滯于M期，這類化合物已作為抗腫瘤藥物成功應用于臨床，并取得了良好的治療效果，如長春堿類和紫杉醇類抗腫瘤藥［13］。本研究中，丹酚酸C能夠抑制微管蛋白聚合，其抑制作用與已知的微管蛋白抑制劑秋水仙素類似，推測丹酚酸C誘導M期阻滯的機制可能與其抑制微管蛋白聚合有關。

藥物通過損傷紡錘體微管結(jié)構(gòu)而使細胞阻滯于M期，若損傷無法修復，就會引起細胞凋亡。目前已知幾乎所有的抗腫瘤藥都是通過誘導細胞凋亡清除腫瘤細胞的。在細胞凋亡過程中，Caspase家族成員發(fā)揮重要作用，其中下游Caspase(如Caspase-3，6和7等)活化后直接對凋亡細胞中的重要底物進行剪切，使細胞解體［14］。本研究結(jié)果顯示，隨著丹酚酸C作用時間的延長，細胞凋亡率增加，同時細胞中Caspase-3和Caspase-6的活性明顯升高，可能是藥物不可逆地抑制微管蛋白聚合，細胞周期阻滯無法進行，通過一系列信號傳導途徑使Caspase活化，從而引起細胞凋亡。

綜上所述，丹參水溶性成分丹酚酸C具有抑制腫瘤細胞增殖的作用，并且可能通過抑制微管蛋白聚合、誘導腫瘤細胞凋亡來發(fā)揮抗腫瘤作用。作為治療心腦血管疾病的常用藥，丹參水溶性成分的安全性和穩(wěn)定性得到了積極評價，因此，作為丹參水溶性單體成分，丹酚酸C的抗腫瘤作用值得進行深入研究。

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