二烯丙基二硫下調(diào)cyclin D1和CDK4的表達(dá)誘導(dǎo)人鼻咽癌CNE2細(xì)胞G1期阻滯

胡 波，邱青朝，賀修培，趙其輝，賀修勝

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是東南亞及我國(guó)南方地區(qū)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重危害著人類(lèi)的健康與生命［1-2］。大蒜及其烯丙基硫化物抗腫瘤實(shí)驗(yàn)研究主要表現(xiàn)為抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化和凋亡，其作用機(jī)制可能為調(diào)節(jié)細(xì)胞周期依賴(lài)激酶、參與腫瘤發(fā)生的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，減少癌基因、增加抑癌基因表達(dá)，調(diào)節(jié)生物酶活性等［3］。二烯丙基二硫(diallyl disulfide，DADS)是從大蒜中提取的一種低分子量的脂溶性成分，對(duì)各種化學(xué)致癌物誘發(fā)的胃癌、結(jié)腸癌、肝癌、乳腺癌、白血病等有明顯的抑制作用，是一種很有開(kāi)發(fā)潛能的抗癌藥物［4-10］。近期研究表明，腫瘤是多基因變化導(dǎo)致細(xì)胞周期紊亂的一類(lèi)疾病，細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制失活，特別是G1/S和G2/M期檢測(cè)點(diǎn)的失活在細(xì)胞癌變過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用;采用藥物激活細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制，從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和分化已成為腫瘤治療的一個(gè)可行的新途徑［11］。本文以人鼻咽癌CNE2細(xì)胞作為研究對(duì)象，觀察DADS對(duì)CNE2細(xì)胞的周期調(diào)控作用，探討DADS誘導(dǎo)CNE2細(xì)胞周期阻滯相關(guān)分子cyclin D1和CDK4動(dòng)態(tài)變化與腫瘤細(xì)胞周期表型改變的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系及細(xì)胞培養(yǎng) 鼻咽癌細(xì)胞系CNE2為低分化鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系，由中國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院建系，由南華大學(xué)腫瘤研究所提供。CNE2細(xì)胞用含10%小牛血清的 RPMI 1640培養(yǎng)液，培養(yǎng)于37℃、含5%CO2的培養(yǎng)箱。待細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶后傳代，0.125%胰酶消化，加適量含血清培養(yǎng)液吹打成單細(xì)胞懸液，按所需濃度接種。DADS加入培養(yǎng)基前用Tween 80溶解，以加有與最高濃度組中等量Tween 80作為溶媒對(duì)照組，Tween 80在培養(yǎng)基中最高體積分?jǐn)?shù)低于0.01%。

1.2 藥品及試劑 ADS購(gòu)自Fluka;Tween 80為華美公司產(chǎn)品;將DADS與Tween 80以1∶2比例充分溶解后，加入0.9%生理鹽水稀釋100倍，作為母液保存于-20℃冰箱中。RPMI 1640購(gòu)置Gibco公司;MTT為Amresco公司產(chǎn)品;BCA蛋白定量試劑盒為Pierce公司產(chǎn)品;TRIzol和AMV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒為Promega公司產(chǎn)品;cyclin D1、CDK4和β-actin單克隆抗體為北京中杉金橋生物技術(shù)公司產(chǎn)品。

1.3 引物 所用引物序列均經(jīng)Primer 5.0設(shè)計(jì)，由大連寶生物公司合成。具體序列如下:cyclin D1上游:5′-TGGTGAACAAGCTCAAGTGGA-3′，下 游:5′-ACTCTGGAGAGGAAGCGTGTG-3′，擴(kuò) 增 產(chǎn) 物 256 bp;CDK4上游5′-TGATGCGCCAGTTTCTAAGAGG-3′，下游:5′-GGTCGGCTTCAGAGTTTCCACA-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物 308 bp;內(nèi)參 β-actin上游:5′-GGACCTGACTGACTACCTC-3′，下 游:5′-CATACTCCTGCTTGCTGAT-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物 553 bp。

1.4 MTT實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，按1×104個(gè)細(xì)胞/孔接種于96孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h后，換成無(wú)酚紅、無(wú)血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，加入處理因素，設(shè)立0對(duì)照、空白對(duì)照和處理組，每組取6個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)到預(yù)定的時(shí)間。然后每孔加入20 μl的5 g·L-1的MTT/PBS溶液，再培養(yǎng)4 h后小心吸去全部上清液，每孔加入200 μl DMSO，振蕩搖勻，使結(jié)晶充分溶解。置酶聯(lián)免疫儀上檢測(cè)波長(zhǎng)570 nm各孔吸光度值，并計(jì)算抑制率。抑制率/IR%=(1-處理組平均吸光度值/對(duì)照組平均吸光度值)×100%。

1.5 流式細(xì)胞儀(FCM)檢測(cè) 不同濃度DADS處理CNE2細(xì)胞48 h后，收集1×109·L-1細(xì)胞，用體積分?jǐn)?shù)為70%乙醇固定，4℃保存待用。采用PI染色，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞群體中處于各個(gè)細(xì)胞周期的細(xì)胞比例。

1.6 RT-PCR鑒定 按TRIzol試劑說(shuō)明程序，分別抽提不同濃度DADS處理CNE2細(xì)胞(48 h)總RNA，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)參照AMV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明，在20 μl體系中加2 μg總 RNA進(jìn)行 cDNA的合成。以cyclin D1、CDK4基因的上下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件:先94℃變性5 min，94℃變性40 s，55℃退火35 s，72℃延伸1 min循環(huán)，總共35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸8 min。以β-actin作為內(nèi)參照，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后紫外透射儀下觀察照像。凝膠用薄層掃描儀進(jìn)行灰度掃描，分析各產(chǎn)物的灰度值(V值)，將目的基因的V值(Vx)分別與對(duì)應(yīng)標(biāo)本的β-actin相比，相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度Rx代表樣本目的基因相對(duì)表達(dá)量，Rx=Vx/β-actin。

1.7 Western blot分析 不同濃度 DADS處理CNE2細(xì)胞48 h后，收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，BCA法蛋白定量。取20 μg蛋白，100℃變性5 min;10%聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉(zhuǎn)膜;膜用5%脫脂牛奶封閉1 h，加入 cyclin D1(1∶500)或 CDK4(1∶200)一抗，4℃搖過(guò)夜，TBS-T 洗膜3×5 min，HRP標(biāo)記二抗(1∶2 000)室溫孵育1 h，TBS-T洗膜3×5 min，ECL發(fā)光劑曝光，顯影。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 結(jié)果采用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，用χ2檢驗(yàn)，t檢驗(yàn)比較處理組與對(duì)照組的區(qū)別，應(yīng)用Sigma plot 8.0軟件進(jìn)行相應(yīng)的圖像處理。

2 結(jié)果

2.1 DADS對(duì)CNE2細(xì)胞的增殖抑制作用 MTT

法測(cè)定結(jié)果顯示，CNE2細(xì)胞在各處理?xiàng)l件下的OD570值及抑制率:90、140、240、400 μmol· L-1DADS處理組其吸光度值比對(duì)照組低，而且隨著濃度增加其吸光值明顯降低，90、140、240、400 μmol·L-1DADS對(duì)CNE2細(xì)胞增殖的抑制率分別為4.0%、13.8%、25.8%、51.2%。Tween 80作為溶媒對(duì)照組對(duì)細(xì)胞增殖無(wú)抑制作用。上述結(jié)果表明，DADS抑制CNE2細(xì)胞增殖的 IC50值在240～400 μmol·L-1之間，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示各濃度組之間差異均有顯著性(Tab 1，P＜0.05)。

Tab 1 The OD570 values of CNE2 cells exposed to DADS at 48 h(±s，n=3)

Tab 1 The OD570 values of CNE2 cells exposed to DADS at 48 h(±s，n=3)

*P＜0.05 vs control

Group Concentration/μmol·L-1 Optical density OD570 Inhibition/%Control 0.782±0.029 Tween 80 0.776±0.040 0.8 DADS 90 0.750±0.021 4.0*140 0.674±0.026 13.8*240 0.580±0.032 25.8*400 0.381±0.014 51.2*

2.2 DADS對(duì)CNE2細(xì)胞周期的影響 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，90、140、250、400 μmol·L-1DADS作用 CNE2細(xì)胞 48 h后，G1期百分率分別為41.2%、48.4%、50.0%、58.3%，與對(duì)照組 26.7%相比差異有顯著性(Tab 2，P＜0.05);說(shuō)明DADS呈濃度依賴(lài)性對(duì)CNE2細(xì)胞有G1期阻滯作用。

Tab 2 Effect of different concertations of DADS on the cell cycle of CNE2 cells± s，n=3)

Tab 2 Effect of different concertations of DADS on the cell cycle of CNE2 cells± s，n=3)

*P＜0.05 vs control

Group Concentration/μmol·L-1 Cell cycle G1 S G2 Control 26.7±1.4 70.1±0.3 1.6±0.3 Tween 80 27.4±1.1 72.1±1.0 1.1±0.4 DADS 90 41.2±0.7 56.4±1.5 2.1±0.5 140 48.4±0.9* 49.7±1.7 1.2±0.2 250 50.0±1.5* 47.4±0.8 2.0±0.9 400 58.3±1.5*39.6±1.1 1.7±0.6

2.3 DADS 對(duì)CNE2 細(xì)胞cyclin D1、CDK4 mRNA表達(dá)的影響 RT-PCR檢測(cè)不同濃度DADS處理CNE2細(xì)胞48 h后，cyclin D1、CDK4 mRNA的表達(dá)變化情況(實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次)。結(jié)果顯示，對(duì)照組cyclin D1、CDK4 mRNA表達(dá)水平較強(qiáng)，不同濃度DADS處理48 h后，cyclin D1、CDK4 mRNA表達(dá)水平隨著濃度增加而減弱，到 400 μmol·L-1時(shí)，cyclinD1、CDK4 mRNA的表達(dá)已分別降到對(duì)照組的14%、30%，差異有顯著性(Fig 1、2，P ＜0.05)。

Fig 1 Effect of DADS on expression of cyclin D1 in CNE2 cells by RT-PCRA:1:Control;2:Tween 80;3:90 μmol·L-1DADS;4:140 μmol·L-1DADS;5:240 μmol·L-1DADS;6:400 μmol·L-1DADS;M:DNA marker;B:Using the gray value of β-actin as an internal reference，and compared with the mean gray values of cyclin D1.*P＜0.05 vs control

Fig 2 Effect of DADS on expression of CDK4 in CNE2 cells by RT-PCRA:1:Control;2:Tween 80;3:90 μmol·L-1DADS;4:140 μmol·L-1DADS;5:240 μmol·L-1DADS;6:400 μmol·L-1DADS;M:DNA marker.B:Using the gray value of β-actin as an internal reference，and compared with the mean gray values of CDK4.*P＜0.05 vs control

2.4 DADS 對(duì) CNE2細(xì)胞 cyclin D1、CDK4蛋白表達(dá)的影響 Western blot分析檢測(cè)CNE2細(xì)胞經(jīng)不同濃度DADS處理48 h后，與對(duì)照組相比，cyclin D1、CDK4蛋白表達(dá)逐漸下降，到DADS濃度為400 μmol·L-1時(shí)，cyclin D1、CDK4 表達(dá)已分別降到對(duì)照組的12%、26%，差異具有顯著性(Fig 3，P＜0.05)。

3 討論

DADS是從大蒜中分離提取的一種油溶性的單體化合物，其藥理作用廣泛，大量實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明，DADS具有明顯抑制人胃癌、結(jié)腸癌、肝癌、白血病等多種腫瘤細(xì)胞增殖的作用，呈濃度-效應(yīng)依賴(lài)關(guān)系;并可誘導(dǎo)這些腫瘤細(xì)胞發(fā)生周期阻滯的作用。本研究通過(guò)MTT比色實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，DADS濃度從90、140、240 到 400 μmol·L-1處理 CNE2 細(xì)胞，其吸光度值比對(duì)照組低，而且隨著濃度增加逐漸減低;相反，隨著濃度增加，DADS對(duì)CNE2細(xì)胞增殖的抑制率從4.0%、13.8%、25.8%到51.2%逐漸增強(qiáng)，表明DADS對(duì)CNE2細(xì)胞具有明顯的生長(zhǎng)抑制作用，呈現(xiàn)濃度-效應(yīng)依賴(lài)關(guān)系;流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果表明，DADS可阻滯CNE2細(xì)胞于G1期，并呈濃度依賴(lài)性。上述研究結(jié)果表明，DADS處理CNE2細(xì)胞后，其細(xì)胞增殖速度減慢，細(xì)胞增殖周期G1期延長(zhǎng)，可能與DADS所致相關(guān)周期阻滯分子的表達(dá)改變有關(guān)。

Fig 3 Effect of DADS on expression of cyclin D1 and CDK4 in CNE2 cells by Western blotA:1:Control;2:Tween 80;3:90 μmol·L-1DADS;4:140 μmol·L-1DADS;5:240 μmol·L-1DADS;6:400 μmol·L-1DADS.B:Using the gray value of β-actin as an internal reference，and compared with the mean gray values of cyclin D1.C:Using the gray value of β-actin as an internal reference，and compared with the mean gray values of CDK4.*P＜0.05 vs control

細(xì)胞周期是一個(gè)復(fù)雜有序并受?chē)?yán)格調(diào)控的過(guò)程，它分為G1期、S期、G2期和M期4個(gè)時(shí)期。細(xì)胞周期調(diào)控是在G1期、S期和G2/M期3個(gè)控制點(diǎn)的控制下，通過(guò)各種調(diào)控因子的激活和失活，使細(xì)胞依次啟動(dòng)和完成細(xì)胞分裂的過(guò)程。細(xì)胞周期中各種調(diào)節(jié)因子組成復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括細(xì)胞周期素(cyclins)、細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶(CDKs)、細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶抑制因子(CKIs)，其核心為CDKs的活性表達(dá)與調(diào)控，cyclins起著正調(diào)控作用，而CKIs為負(fù)調(diào)控因子［12］。細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制的紊亂，特別是G1/S期檢測(cè)點(diǎn)和G2/M期檢測(cè)點(diǎn)的改變，在細(xì)胞癌變過(guò)程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用［13-14］。cyclin Dl、CDK4 是 G1/S 期關(guān)鍵的正性調(diào)節(jié)因子，兩者首先結(jié)合形成cyclin Dl/CDK4復(fù)合物，激活抑癌基因pRb，pRb磷酸化后，與轉(zhuǎn)錄因子E2F分離，解除了對(duì)E2F的抑制作用，使E2F發(fā)揮轉(zhuǎn)錄活性，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖［15-16］。當(dāng) cyclin Dl、CDK4基因激活時(shí)，則cyclin Dl、CDK4蛋白持續(xù)高表達(dá)，將導(dǎo)致G1期縮短，提前進(jìn)入S期，使細(xì)胞增殖失控，最終形成腫瘤［17］。本實(shí)驗(yàn)通過(guò) RT-PCR和Western blot分析顯示，CNE2細(xì)胞cyclin Dl和CDK4的表達(dá)量較高;隨著DADS處理CNE2細(xì)胞濃度逐漸增加時(shí)，其表達(dá)量反而減少，與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。上述結(jié)果表明，DADS誘導(dǎo)CNE2細(xì)胞G1期阻滯的主要機(jī)制可能是通過(guò)降低cyclin Dl和CDK4表達(dá)量，從而負(fù)調(diào)控G1/S期檢測(cè)點(diǎn)，阻滯細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期。

綜上所述，DADS能抑制CNE2細(xì)胞增殖，其機(jī)制可能與DADS誘導(dǎo)CNE2細(xì)胞cyclin Dl和CDK4表達(dá)下調(diào)，將瘤細(xì)胞阻滯于G1期有關(guān)，但其作用的確切分子機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究，從而找出DADS抗腫瘤的靶點(diǎn)。

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