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      基于光波導(dǎo)分光光譜技術(shù)研究蛋白質(zhì)與亞甲基藍的競爭吸附行為

      2010-11-30 10:50:06祁志美
      物理化學(xué)學(xué)報 2010年10期
      關(guān)鍵詞:緩沖溶液波導(dǎo)光度

      鄧 琳 祁志美

      (中國科學(xué)院電子學(xué)研究所,傳感技術(shù)國家重點實驗室,北京 100190)

      基于光波導(dǎo)分光光譜技術(shù)研究蛋白質(zhì)與亞甲基藍的競爭吸附行為

      鄧 琳 祁志美*

      (中國科學(xué)院電子學(xué)研究所,傳感技術(shù)國家重點實驗室,北京 100190)

      通過利用時間分辨光波導(dǎo)分光光譜技術(shù)原位測量從蛋白質(zhì)-亞甲基藍(MB)混合水溶液吸附到親水玻璃光波導(dǎo)表面的MB可見光吸收譜,觀測到在溶液pH值低于蛋白質(zhì)等電點時MB與牛血清蛋白(BSA)以及MB與血紅蛋白(Hb)存在競爭吸附行為,進一步測得這種競爭吸附行為對蛋白質(zhì)濃度十分敏感,可以用于簡單測定溶液中的蛋白質(zhì)含量.基于Langmuir等溫吸附理論推導(dǎo)出了兩種分子競爭吸附的動力學(xué)方程,并利用該動力學(xué)方程對實驗測得的吸光度隨時間變化曲線進行了最佳擬合,揭示了玻璃表面吸附的MB分子個數(shù)在達到最大值后隨時間呈指數(shù)衰減,同時得出擬合參數(shù)與蛋白質(zhì)濃度呈準(zhǔn)線性關(guān)系.

      光波導(dǎo)分光光譜技術(shù); 競爭吸附; 亞甲基藍; 蛋白質(zhì)探測

      蛋白質(zhì)作為生命的物質(zhì)基礎(chǔ)之一,與各種形式的生命活動緊密聯(lián)系在一起,它在催化生命體內(nèi)的各種反應(yīng),調(diào)節(jié)新陳代謝以及控制遺傳信息等方面都起著至關(guān)重要的作用.因此對于蛋白質(zhì)的探測在臨床診斷、食品安全、生命現(xiàn)象研究等方面都有重要的應(yīng)用價值.傳統(tǒng)的探測蛋白質(zhì)含量的方法主要有Folin-酚試劑法(Lowry法)、雙縮脲法(Biuret法)、凱氏定氮法(Kjeldahl法)、考馬斯亮藍法(Bradford法)等 ,操作時需要對待測樣品進行復(fù)雜的化學(xué)前處理過程.

      隨著集成光學(xué)技術(shù)的發(fā)展和波導(dǎo)制造技術(shù)的日益成熟,基于光波導(dǎo)傳感技術(shù)的蛋白質(zhì)探測方法越來越受到人們的關(guān)注[7-13].這類方法具有靈敏度高、抗電磁干擾、輕便易集成等優(yōu)點,但由于蛋白質(zhì)分子通常在可見光波段是無色的,直接探測比較困難,通常需要借助于抗原抗體配對或熒光標(biāo)記等輔助處理過程,使得整個測試過程比較繁瑣.本文利用亞甲基藍(MB)作為吸附指示劑,采用時間分辨光波導(dǎo)分光光譜技術(shù)[14-20]實時監(jiān)測蛋白質(zhì)與MB在親水玻璃光波導(dǎo)表面的競爭性吸附,通過探測MB對導(dǎo)波光的吸收來間接探測溶液中的蛋白質(zhì).該方法操作簡便,樣品需求量極少,無需其它任何標(biāo)記物,只要選擇合適的緩沖溶液就可以檢測各類蛋白質(zhì).下文對牛血清蛋白(BSA)和血紅蛋白(Hb)的探測證實了這種方法的可行性,而且其探測的靈敏度可以達到 10-8mol·L-1量級.

      1 實驗部分

      1.1 實驗儀器及試劑

      LS-1-LL型鹵鎢燈、光纖、HR4000型CCD光譜分析儀(美國Ocean Optics公司);50 μm厚平面玻璃光波導(dǎo)(日本Matsunami Glass公司);BQ50-1J型蠕動泵(中美合資保定蘭格恒流泵有限公司);HARKESPCA接觸角測量儀(北京哈科試驗儀器廠);THB-2000B型pH計(上海宏勝集團);玻璃棱鏡、透鏡、線性偏振片(國產(chǎn)).

      亞甲基藍(MB)、磷酸、四硼酸鈉(分析純,北京化學(xué)試劑公司);牛血清蛋白(BSA)、血紅蛋白(Hb)(美國Sigma公司).

      1.2 競爭吸附的探測方法

      每種蛋白質(zhì)都有其特定的等電點(PI),如果溶液的pH值在蛋白質(zhì)的等電點之上,那么蛋白質(zhì)分子在溶液中帶負(fù)電,反之則帶正電,而亞甲基藍(分子式為[C16H18N3S]+Cl-)為陽離子染料,在水溶液中電離后色基[C16H18N3S]+始終帶正電.由于未經(jīng)修飾的玻璃光波導(dǎo)表面顯負(fù)電性,如果調(diào)節(jié)溶液的pH值到蛋白質(zhì)的等電點之下,那么蛋白質(zhì)分子與MB分子在光波導(dǎo)表面形成競爭吸附的關(guān)系.通常蛋白質(zhì)分子體積較大,吸附慢但吸附牢固,而染料分子小,吸附快但吸附不牢固,因此混合溶液的吸光度應(yīng)該是隨時間迅速上升然后又逐漸下降至平衡的過程.如果選取吸收譜峰值處的某一波長(本文均采用λ=605 nm)處的吸光度數(shù)據(jù)進行觀察,可以發(fā)現(xiàn)對于某種特定的蛋白質(zhì),不同的濃度對應(yīng)不同的吸光度下降速率;而對于同一濃度的蛋白質(zhì),在不同pH值的緩沖溶液中,對應(yīng)的吸光度下降速率也不同,這是本文探測溶液中蛋白質(zhì)含量的主要依據(jù).

      實驗時首先用去離子水配制濃度為1 mmol·L-1的標(biāo)準(zhǔn)MB溶液和濃度分別為1,2,5和10 μmol· L-1的BSA溶液及Hb溶液備用.對于BSA,配制了pH值分別為2.03和4.02的緩沖溶液,溶液的pH值使用pH計測得,可精確到小數(shù)點后兩位.本實驗中使用的去離子水的pH值為5.89,磷酸經(jīng)去離子水稀釋后用來提供pH值小于去離子水的各種緩沖溶液.對于Hb,配制了pH值分別為4.02和7.70的緩沖溶液,其中pH值為7.70的緩沖溶液由四硼酸鈉配制得到.

      測試所用的溶液是向2.5 mL緩沖溶液中滴入50 μL 1 mmol·L-1MB備用溶液和100 μL蛋白質(zhì)備用溶液.因此最終得到的待測溶液中,MB的濃度為18.868 μmol·L-1,BSA及Hb的濃度分別為0.038, 0.075,0.189和0.377 μmol·L-1.為了準(zhǔn)確觀察蛋白質(zhì)濃度對吸光度的影響,每次實驗中MB的濃度保持不變.

      采用時間分辨光波導(dǎo)分光光譜法探測蛋白質(zhì)和MB混合緩沖溶液在親水玻璃表面的競爭吸附行為,探測裝置及操作方法在參考文獻[20]中已有詳細(xì)的論述.

      2 結(jié)果與討論

      2.1 BSA與MB的競爭吸附結(jié)果

      BSA是血液的主要成分,相對分子質(zhì)量為66000 Da,等電點為4.7.為了對比實驗結(jié)果,首先以去離子水(pH=5.89)為緩沖溶液進行實驗,由于去離子水的pH值高于BSA的等電點,因此觀察不到競爭吸附現(xiàn)象.圖1顯示了pH=5.89的緩沖溶液中MB和BSA的共吸附光譜隨時間的變化,插圖給出了λ=605 nm處的吸光度隨時間的變化,其中BSA的濃度為 0.377 μmol·L-1,MB的濃度為 18.868 μmol·L-1.

      圖1 利用pH 5.89的MB-BSA混合水溶液得到的MB吸附層的光波導(dǎo)吸收光譜Fig.1 OWG absorption spectra of MB adsorbed from the pH 5.89 mixed aqueous solution of MB and BSAInsert shows the absorbance at λ=605 nm versus time.

      下面分別采用pH值為2.03和4.02的緩沖溶液進行實驗,BSA的濃度分別為0.038,0.075,0.189和0.377 μmol·L-1,測試結(jié)果如圖2和圖3所示.由于滴入溶液的時刻比CCD開始記錄數(shù)據(jù)的時刻有所延遲,所以吸光度曲線不是嚴(yán)格從t=0 s開始上升.圖2和圖3中的曲線反映出BSA分子與亞甲基藍之間具有明顯的競爭吸附現(xiàn)象,最初亞甲基藍迅速吸附到光波導(dǎo)表面,吸光度迅速上升至峰值,之后BSA分子開始吸附并使得亞甲基藍從光波導(dǎo)表面脫附,吸光度逐漸下降,最終達到平衡.對于某一特定pH值的緩沖溶液,BSA濃度越高,吸光度下降越快,說明競爭吸附現(xiàn)象越明顯.

      為了討論光波導(dǎo)芯片的可重復(fù)性使用,每進行一步實驗都會記錄光波導(dǎo)表面五個不同位置的水接觸角變化,每次實驗完畢使用酒精仔細(xì)擦拭玻璃光波導(dǎo)表面,記錄結(jié)果列于表1.從表中數(shù)據(jù)可以看出,酒精清洗可使光波導(dǎo)的水接觸角恢復(fù)到實驗前的水平,重復(fù)性良好.

      表1 在各個實驗階段測得的玻璃光波導(dǎo)表面的水接觸角Table 1 Water contact angles of the glass waveguide surface measured at different time points during the experiment

      2.2 Hb與MB的競爭吸附結(jié)果

      Hb是高等生物體內(nèi)負(fù)責(zé)運載氧的一種蛋白質(zhì),它的等電點為6.8,分子量為68000 Da.對于Hb我們同樣測試了0.038,0.075,0.189和0.377 μmol·L-1四個濃度的蛋白質(zhì)溶液.由于Hb的等電點高于去離子水的pH值,因此實驗用的緩沖溶液的pH值有所調(diào)整,分別采用了磷酸配制的pH=4.02的緩沖溶液和四硼酸鈉配制的pH=7.70的緩沖溶液.圖4和圖5給出了這兩種pH條件下的測試結(jié)果,在pH= 4.02的緩沖溶液中可以觀察到明顯的競爭吸附現(xiàn)象,而在pH=7.70的緩沖溶液中則無法觀察到競爭吸附現(xiàn)象,這跟所預(yù)期的結(jié)果相一致.

      圖2 利用pH 2.03的MB-BSA混合水溶液得到的MB吸附層在λ=605 nm處的光波導(dǎo)吸光度隨時間的變化Fig.2 Time courses of OWG absorbance at λ=605 nm of MB adsorbed from the pH 2.03 mixed aqueous solutions of MB and BSA

      圖3 利用pH 4.02的MB-BSA混合水溶液得到的MB吸附層在λ=605 nm處的光波導(dǎo)吸光度隨時間的變化Fig.3 Time courses of OWG absorbance at λ=605 nm of MB adsorbed from the pH 4.02 mixed aqueous solutions of MB and BSA

      2.3 競爭吸附的動力學(xué)模型

      光波導(dǎo)表面蛋白質(zhì)亞單分子層和MB亞單分子層的吸附都滿足Langmuir吸附模型[21-25],這里討論兩種不同分子的競爭吸附動力學(xué)模型.

      對于MB分子和蛋白質(zhì)分子,其吸附動力學(xué)方程可以表示為式(1)和(2):

      其中,N1和N2分別是某一時刻MB分子和蛋白質(zhì)分子的表面覆蓋率,Nmax是最大表面覆蓋率,ka1、kd1和ka2、kd2分別是MB和蛋白質(zhì)的吸附、脫附速率常數(shù),c1和c2分別為MB和蛋白質(zhì)的體溶液濃度,55.5為水的濃度(mol·L-1).

      當(dāng)吸光度在時刻tm達到最大值時,圖2-圖4中的曲線達到拐點,即dN1/dt=0,得到MB的覆蓋率峰值(N1peak)為:當(dāng)N1達到峰值時,可以認(rèn)為dN2/dt=-dN1/dt,由此得到:

      將式(5)移項后兩端積分,得到:

      圖4 利用pH 4.02的MB-Hb混合水溶液得到的MB吸附層在λ=605 nm處的光波導(dǎo)吸光度隨時間的變化Fig.4 Time courses of OWG absorbance at λ=605 nm of MB adsorbed from the pH 4.02 mixed aqueous solutions of MB and Hb

      根據(jù)公式(8)可知,在競爭吸附過程中MB的表面覆蓋率隨時間的變化滿足指數(shù)衰減關(guān)系.公式(8)還指出當(dāng)時間趨于無窮大時N1t=η,也就是說在競爭吸附達到平衡時MB的表面覆蓋率為η.在上面的式子中,α、β、η,τ都是只與ka1、kd1、ka2、kd2、c1、c2、Nmax有關(guān)的常數(shù).

      圖5 利用pH 7.70的MB-Hb混合水溶液得到的MB吸附層在λ=605 nm處的光波導(dǎo)吸光度隨時間的變化Fig.5 Time courses of OWG absorbance at λ=605 nm of MB adsorbed from the pH 7.70 mixed aqueous solutions of MB and Hb

      圖6 模擬計算得出的擬合參數(shù)τ-1與蛋白質(zhì)濃度的線性關(guān)系Fig.6 Linear relationship between the fitting parameter τ-1and protein concentration obtained with simulationk:rate constant,subscripts 1 and 2 denote the MB and protein, respectively,and subscripts a and d refer to adsorption and desorption,respectively.

      根據(jù)光波導(dǎo)消逝場理論分析可知在時刻t測得的給定波長的吸光度(At)與該時刻的MB表面覆蓋率成正比,即At=γN1t,Amax=γN1peak,Aeq=γη,其中γ為比例常數(shù),Amax為峰值吸光度,Aeq是競爭吸附達到平衡時的吸光度.因此由公式(8)可以得出公式(9):

      圖7 被吸附的MB分子在λ=605 nm處的吸光度隨時間的變化及其最佳擬合曲線Fig.7 Best fitting curve of the time course of absorbance at λ=605 nm for adsorbed MB molecules cBSA=0.038 μmol·L-1,cMB=18.868 μmol·L-1,pH=2.03

      在公式(8)和(9)中參數(shù)τ的單位為s,其含義為吸光度從其峰值下降了峰值與穩(wěn)定值之差的1/e所用的時間,或者說MB覆蓋率從其峰值下降了峰值與穩(wěn)定值之差的1/e所用的時間.給定ka1、kd1、ka2、kd2、 c1和Nmax,利用公式(8)對τ和c2的依賴關(guān)系進行模擬計算,得到如圖6所示的結(jié)果.從圖中可看出τ的倒數(shù)(τ-1)隨著c2的增大而線性增加.由此可見增大蛋白質(zhì)濃度能夠使吸附競爭加劇,使競爭吸附達到平衡所用的時間縮短.在利用公式(9)對圖2-圖4中的實驗曲線進行擬合時把τ-1直接作為擬合參數(shù).為了驗證擬合效果,選取圖2(a)進行擬合,得到圖7所示的結(jié)果,實驗曲線與擬合曲線吻合良好,說明上述理論推導(dǎo)得出的擬合公式具有充分的合理性.

      根據(jù)擬合的結(jié)果,我們可以給出擬合參數(shù)τ-1與BSA濃度及Hb濃度的關(guān)系曲線,圖8(a)和(b)分別給出了pH=2.03和pH=4.02時擬合參數(shù)τ-1與BSA濃度的關(guān)系圖.圖9給出了pH=4.02時擬合參數(shù)τ-1與Hb濃度的關(guān)系圖.可以發(fā)現(xiàn)對于不同的pH條件以及不同的蛋白質(zhì),擬合參數(shù)τ-1隨蛋白質(zhì)濃度的升高而增大,二者呈準(zhǔn)線性關(guān)系,這與圖6給出的模擬計算結(jié)果一致.

      圖8 (a)pH=2.03和(b)pH=4.02時擬合參數(shù)τ-1與BSA濃度的關(guān)系Fig.8 Relationships between the fitting parameter τ-1 and BSA concentration obtained at(a)pH=2.03 and (b)pH=4.02

      圖9 pH=4.02時擬合參數(shù)τ-1與Hb濃度的關(guān)系Fig.9 Relationship between the fitting parameter τ-1 and Hb concentration obtained at pH=4.02

      3 結(jié) 論

      本文研究了吸附指示劑MB與兩種蛋白質(zhì)BSA和Hb在親水玻璃光波導(dǎo)表面的競爭吸附行為,給出了一種通過探測MB對導(dǎo)波光的吸收來間接探測溶液中蛋白質(zhì)含量的方法.該方法基于光波導(dǎo)分光光譜技術(shù),與其它基于光波導(dǎo)的探測技術(shù)相比,有效地避免了復(fù)雜的樣品前處理過程,如:蛋白質(zhì)抗原抗體配對以及熒光標(biāo)記等,使得整個測試過程簡便易操作.文中根據(jù)Langmuir吸附模型推導(dǎo)出了兩種分子競爭吸附的動力學(xué)方程,根據(jù)推導(dǎo)結(jié)果對實驗測得的吸光度曲線進行擬合,發(fā)現(xiàn)實驗數(shù)據(jù)與理論推導(dǎo)符合得很好.由于競爭吸附的存在,MB與蛋白質(zhì)混合溶液的吸光度在達到峰值以后隨時間呈指數(shù)衰減,對于某一特定的蛋白質(zhì),當(dāng)緩沖溶液的pH值一定時,蛋白質(zhì)濃度越高,吸光度下降越快,即衰減系數(shù)越大.考察不同情況下擬合參數(shù)與蛋白質(zhì)濃度的關(guān)系,得到的曲線具有良好的規(guī)律性,為溶液中蛋白質(zhì)含量的探測提供了依據(jù).

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      May 24,2010;Revised:July 5,2010;Published on Web:August 17,2010.

      Study of Competitive Adsorption Behavior of Protein and Methylene Blue by Optical Waveguide Spectroscopy

      DENG Lin QI Zhi-Mei*
      (State Key Laboratory of Transducer Technology,Institute of Electronics,Chinese Academy of Sciences, Beijing 100190,P.R.China)

      We used time-resolved optical waveguide spectroscopy(OWGS)to in-situ measure visible absorption spectrum for methylene blue(MB)adsorbed on a hydrophilic glass waveguide from an aqueous solution containing proteins such as bovine serum albumin(BSA)and hemoglobin(Hb).The competitive adsorption of MB and the protein was detected at a solution pH lower than the isoelectric point of the protein.Since the competitive adsorption behavior of MB and the protein is very sensitive to the protein concentration,the protein content in the mixed solution was readily determined by time-resolved OWGS.In addition,a kinetic equation for the competitive adsorption of the two molecules was deduced based on the Langmuir adsorption isotherm.The best fit of the measured time course of the absorbance with the theoretical kinetic equation reveals that the number of MB molecules adsorbed on the surface exponentially decreases with time after reaching a maximum.A quasi-linear relationship between the fitting parameters and the protein concentration was also obtained.

      Optical waveguide spectroscopy; Competitive adsorption; Methylene blue; Protein detection

      O647

      *Corresponding author.Email:zhimei-qi@mail.ie.ac.cn;Tel:+86-10-58887533.

      The project was supported by the National Key Basic Research Program of China(973)(2009CB320300),National Natural Science Foundation of China(60978042),and the BaiRenJiHua Program of Chinese Academy of Sciences.

      國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃(973)(2009CB320300),國家自然科學(xué)基金(60978042)和中科院“百人計劃”擇優(yōu)支持項目資助

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