孫永林 ，肖 俊，余海忠，湯尚文

（襄樊學(xué)院 化學(xué)工程與食品科學(xué)學(xué)院，湖北 襄樊 441053）

酶法提取襄麥冬總黃酮的單因素試驗(yàn)研究

孫永林 ，肖 俊，余海忠，湯尚文

（襄樊學(xué)院 化學(xué)工程與食品科學(xué)學(xué)院，湖北 襄樊 441053）

以襄麥冬為原料，通過單因素試驗(yàn)，采用酶法提取工藝對影響襄麥冬總黃酮提取的酶的添加量、酶解時間、酶解溫度和介質(zhì)pH值進(jìn)行了研究. 結(jié)果表明影響襄麥冬黃酮提取的主要因素為：酶添加量40mg，酶解時間3h，酶解溫度50℃，介質(zhì)pH值為5.0.

襄麥冬；纖維素酶；總黃酮；單因素試驗(yàn)

襄麥冬為百合科山麥冬屬(Liriope Lour.)植物湖北麥冬(Liriope spicata(Thunb.) Lour. Var. prolifera Y. T. Ma)的干燥塊根，是湖北省道地藥材，被收載于《中華人民共和國藥典》(1995年、2000年、2005年版)山麥冬項(xiàng)下. 因主產(chǎn)區(qū)位于襄樊市所轄的襄陽區(qū)歐廟鎮(zhèn)、老河口等縣市，故名襄麥冬[1]. 總黃酮是襄麥冬主要活性成分之一，具有良好的抗炎、抗應(yīng)激、抗組胺、心血管保護(hù)功能和磷酸化抑制等作用[2]. 傳統(tǒng)的提取總黃酮的方法如水提、醇提等無法使包圍黃酮類化合物的細(xì)胞壁破裂，存在巨大的傳質(zhì)阻力，致使提取效果受到限制[3]. 而纖維素酶能使細(xì)胞壁疏松、破裂，降低傳質(zhì)阻力，從而提高提取效率，且條件溫和，環(huán)保無毒. 本文采用酶法提取工藝對影響襄麥冬總黃酮提取的酶的添加量、酶解時間、酶解溫度和介質(zhì)PH值進(jìn)行研究，以期為襄麥冬的開發(fā)利用提供理論基礎(chǔ).

1 材料和方法

1.1 儀器、材料與試劑

UV-1750紫外可見分光光度計(jì)(日本島津)；KQ2200(40KHz)臺式超聲波清洗器(江蘇昆山)；襄麥冬(2010年3月采集于襄樊市歐廟鎮(zhèn)GAP種植基地)；纖維素酶(武漢遠(yuǎn)城藥業(yè)有限公司)，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(Sigma公司)，其它試劑如亞硝酸鈉、硝酸鋁等均為分析純.

1.2 方法

1.2.1總黃酮的提取方法

1.2.1.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

準(zhǔn)確稱取經(jīng)105℃干燥至恒重的蘆丁20mg，置于250ml容量瓶中，用體積濃度為60%的乙醇稀釋至刻度，搖勻，此標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為0.08mg/ml.分別吸取標(biāo)準(zhǔn)液0、0.5 ml、1 ml、2 ml、3 ml、4 ml、5 ml于10ml容量瓶中，加入5% NaNO20.3 ml，搖勻，放置6min，加入0.3ml質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的Al(NO3)3，搖勻、放置6min，再加入5%NaOH溶液4ml，加水至刻度，搖勻，靜置10min，于分光光度計(jì)下掃描. 然后掃描麥冬黃酮提取液，測定發(fā)現(xiàn)兩者均在291nm處有最大吸收峰. 以試劑空白作參比液，以蘆丁濃度為橫坐標(biāo)、291nm處吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線. 標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1，其中y代表吸光度，x代表濃度. 得回歸方程y = 26.096x + 0.0797，R2=0.9922，蘆丁在0.005~0.041 mg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好.

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.2.1.2 樣品總黃酮含量的測定

稱取1g干燥至恒溫的襄麥冬粉末(過60目篩)裝入試管，添加適量纖維素酶(以原料干重計(jì))，添加蒸餾水10ml，置于水浴鍋內(nèi)升至所需溫度，調(diào)整pH值，保持恒溫一定時間后在沸水浴上滅酶10 min. 在樣品中加入無水乙醇15ml（此時乙醇濃度為50%，料液比1:25），浸泡一段時間后，在常溫下用超聲波提取60min，布氏抽濾，用蒸餾水將浸提劑定容至50ml，移取0.5ml于100ml容量瓶中，加顯色劑（NaNO2-Al(NO3)3-NaOH），用蒸餾水浸提劑定容至100ml，用紫外分光光度計(jì)測定樣品的吸光度值，由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得麥冬黃酮的濃度.

1.2.2 纖維素酶酶解單因素試驗(yàn)

1.2.2.1 酶的添加量對提取率的影響

取5只干燥試管，分別稱取1g已達(dá)恒重的襄麥冬裝入其中，分別加入10mg，20mg，30mg，40mg，50mg的纖維素酶(以原料干重計(jì))，加水10ml，在水浴50℃下酶解2h，然后在90℃下滅酶10min，加入15ml無水乙醇提取60min，抽濾、顯色，定容，以試劑空白為參比液，于291nm處測吸光值.

1.2.2.2 酶解時間對提取率的影響

取5只干燥試管，分別稱取1g已達(dá)恒重的襄麥冬裝入其中，加入30mg的纖維素酶(以原料干重計(jì))，加水10ml，在水浴50℃下分別酶解1h，2h，3h，4h，5h，然后在90℃下滅酶10min，加入15ml無水乙醇，抽濾、顯色，定容，以試劑空白為參比液，于291nm處測吸光值.

1.2.2.3 酶解溫度對提取率的影響

取5只干燥試管，分別稱取1g已達(dá)恒重的襄麥冬裝入其中，加入30mg的纖維素酶(以原料干重計(jì))，加水10ml，分別在水浴30℃，40℃，50℃，60℃，70℃下酶解2h，然后在90℃下滅酶10min，加入15ml無水乙醇，抽濾、顯色，定容，以試劑空白為參比液，于291nm處測吸光值.

1.2.2.4 介質(zhì)PH值對提取率的影響

取5只干燥試管，分別稱取1g已達(dá)恒重的襄麥冬裝入其中，加入30mg的纖維素酶(以原料干重計(jì))，加水10ml，分別調(diào)節(jié)PH值為3，4，5，6，7，在水浴50℃下酶解2h，然后在90℃下滅酶10min，加入15ml無水乙醇，抽濾、顯色，定容，以試劑空白為參比液，于291nm處測吸光值.

2 結(jié)果與分析

2.1 酶的添加量對提取率的影響

在其他因素不變的情況下，考查酶的添加量對黃酮提取率的影響，測定結(jié)果見圖2. 由圖2可知，隨著加酶量的增加，提取率不斷上升. 當(dāng)加酶量達(dá)到40mg時，總黃酮提取率基本已達(dá)到最大值. 并得知，加酶量超過40mg后，提取率的變化不大，說明此時溶液中酶與底物濃度達(dá)到飽和狀態(tài). 因此采用加酶量為40mg為宜.

圖2 酶的添加量對黃酮提取率的影響

圖3 酶解時間對黃酮提取率的影響

2.2酶解時間對提取率的影響

在其他因素不變的情況下，考查酶解時間對黃酮提取率的影響，測定結(jié)果見圖 3. 由于酶解時間與酶用量有較大關(guān)系，如果酶用量較大，則可適當(dāng)減少酶解時間；而酶用量較少，其酶解時間相對較長. 由圖3可知，隨著時間增加，總黃酮提取率逐漸提高，4h時總黃酮提取率最大，可能大部分黃酮類化合物已溶出；再繼續(xù)延長時間，浸出率反而下降，可能是因?yàn)辄S酮類化合物的穩(wěn)定性下降的緣故，因此酶解時間以4h為宜.

2.3 酶解溫度對提取率的影響

在其他因素不變的情況下，考查酶解溫度對黃酮提取率的影響，測定結(jié)果見圖4. 溫度對襄麥冬黃酮提取率的影響主要在于影響溶質(zhì)的擴(kuò)散和酶的活性. 纖維素酶通常在40℃~60℃時活性最強(qiáng)，溫度過低，酶活性降低；而溫度過高可使酶蛋白變性失活，喪失催化能力. 由圖4可知，50℃以下，總黃酮浸出率隨溫度升高而增大，當(dāng)溫度達(dá)50℃時總黃酮浸出率最大；隨后溫度進(jìn)一步升高，總黃酮浸出率逐漸減小，這是因50℃時纖維素酶發(fā)揮最大活性，有利于黃酮類化合物溶出，提高襄麥冬中總黃酮浸出率. 溫度進(jìn)一步提高，則不利于酶活力發(fā)揮.

2.4介質(zhì)pH值對提取率的影響

在其他因素不變的情況下，考查介質(zhì)pH值對黃酮提取率的影響，測定結(jié)果圖5. 酶活性與pH值密切相關(guān)，pH值會影響酶活性、酶與底物的結(jié)合以及酶的穩(wěn)定性. 纖維素酶的最適pH值一般為4.5~6.0，根據(jù)酶解底物不同會有相應(yīng)的變化. 由圖5可知，在酸性環(huán)境中纖維素酶活性較高，這是由于酶活力受pH影響較大，當(dāng)pH為5時有利于復(fù)合酶發(fā)揮最大活力，破壞細(xì)胞壁，降低傳質(zhì)阻力，從而有利于襄麥冬中黃酮提??；過高或過低都不利于酶解作用，浸提效率較低.

3 結(jié)論

本次實(shí)驗(yàn)考察了影響纖維素酶作用的一些主要因素，酶添加量、酶解時間、酶解溫度、介質(zhì)pH值這4個因素對黃酮提取率的影響，結(jié)果表明影響襄麥冬黃酮提取的理想因素為：酶添加量40mg，酶解時間3h，酶解溫度50℃，介質(zhì)pH值為5.0.

襄麥冬中黃酮類物質(zhì)向提取介質(zhì)擴(kuò)散時，必須克服細(xì)胞壁及細(xì)胞間質(zhì)雙重阻力. 由于細(xì)胞壁及細(xì)胞間質(zhì)主要成分是纖維素等物質(zhì)，本研究采用對纖維素具有專一降解作用的纖維素酶作用于植物材料，使纖維素等物質(zhì)降解，減小細(xì)胞壁、細(xì)胞間質(zhì)等傳質(zhì)屏障，促進(jìn)了有效成分從細(xì)胞內(nèi)向提取介質(zhì)的擴(kuò)散，且作用條件溫和、可明顯提高植物成分的提取效率[4-5]，因而采用酶法提取工藝為襄麥冬總黃酮的提取提供了一種新方法.

[1] 田 宏, 王蕾蕾. 湖北麥冬的生藥鑒別[J]. 時珍國藥研究, 1997, 8(6): 525-526.

[2] 余伯陽, 殷 霞, 徐國鈞, 等. 湖北麥冬與浙麥冬質(zhì)量的研究——免疫活性比較[J]. 中國中藥雜志, 1991, 16(10): 584-585.

[3] 李 莉, 劉成梅, 田建文, 等. 現(xiàn)代提取分析技術(shù)在黃酮類化合物中的應(yīng)用[J]. 江西食品工業(yè), 2006, 22(4): 42-44.

[4] 張立娟, 余國萍, 周國華. 黑木耳多糖酶法提取條件的研究[J]. 食品研究與開發(fā), 2005, 26(3): 89-91.

[5] 張巾英, 張明春. 應(yīng)用纖維素酶提取中草藥有效成分的研究進(jìn)展[J]. 上海中醫(yī)藥雜志, 2007, 41(1): 79-81.

Extractting Total Flavonoids from Liriope spicata（Thunb.） Lour. var. prolifera Y. T .Ma by the Way of Single Factor Test and Enzymolysis Methods

SUN Yong-lin, XIAO Jun, YU Hai-zhong, TANG Shang-wen
（School of Chemical Engineering and Food Science, Xiangfan University, Xiangfan 441053, China）

Extractting total flavonoids from Liriope spicata（Thunb.）Lour. var. prolifera Y. T .Ma was studied by the way of single factor test and enzymolysis methods, including enzyme dosage, enzymolysis time, enzymolysis temperature and pH. The results showed the mainly effect on the extraction of the total flavonoids as follows: enzyme dosage 40mg , enzymolysis time of 3h, enzymolysis temperature of 50℃, medium pH 5.0.

Liriope spicata(Thunb.) Lour. var. prolifera Y. T. Ma; Cellulose enzyme; Total flavonoids; Single factor test

Q946

A

1009-2854(2010)08-0032-03

2010-07-16

湖北省教育廳中青年項(xiàng)目(Q20102601)

孫永林(1973— ), 女, 湖北襄樊人, 襄樊學(xué)院化學(xué)工程與食品科學(xué)學(xué)院講師.

徐 杰）