何桂霞,易海燕,郭建生,3,裴 剛

1湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院;2湖南省教育廳中藥現(xiàn)代化研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室; 3國(guó)家中醫(yī)藥管理局藥性與藥效研究三級(jí)實(shí)驗(yàn)室,長(zhǎng)沙 410208

烏藥為樟科植物烏藥 Lindera aggregata(Sims) Kosterm的干燥塊根[1],為常用中藥,具有順氣止痛、溫腎散寒的功效,廣泛用于胸腹脹痛、氣逆喘急、膀胱虛冷、遺尿尿頻、疝氣、痛經(jīng)等證[2-5]?，F(xiàn)代研究表明,烏藥主要含有揮發(fā)油、異喹啉生物堿、呋喃倍半萜及其內(nèi)酯類(lèi)成分[6]。對(duì)于烏藥揮發(fā)油成分的分析,只見(jiàn)于水蒸汽蒸餾法提取和微波-蒸餾法報(bào)道[7-9]。超臨界流體萃取是近 20年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)新型物理萃取技術(shù),在中草藥研究方面顯示出越來(lái)越廣闊的發(fā)展?jié)摿10,11]。本文通過(guò)超臨界 CO2流體萃取(SFE-CO2)與傳統(tǒng)水蒸氣蒸餾法 (SD)提取烏藥中的揮發(fā)性成分,運(yùn)用 GC-MS對(duì)兩種提取方法進(jìn)行化學(xué)成分的比較分析,為合理高效地開(kāi)發(fā)利用烏藥提供依據(jù)。

1 儀器與試劑

GC-MS-QP2010型氣相質(zhì)譜聯(lián)用儀 (日本 Shimadzu公司);超臨界 CO2萃取裝置 (杭州華黎泵業(yè)有限公司);烏藥藥材,購(gòu)于岳陽(yáng)藥材公司,經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室劉塔斯教授鑒定為樟科植物 L indera aggregata(Sims)Kosterm的干燥塊根。

2 方法

2.1 烏藥揮發(fā)油的制備

2.1.1 超臨界 CO2萃取法

將烏藥粉碎后,過(guò) 20目篩,稱(chēng)取 400.0 g裝入超臨界萃取斧中,萃取溫度 45℃,萃取壓力 30 Mpa,分離釜Ⅰ壓力 10MPa,溫度為 40℃,分離釜Ⅱ壓力 5 MPa,溫度為 27℃,萃取時(shí)間為 2 h,得到揮發(fā)油為橘黃色,得率為 6.67%。

2.1.2 水蒸汽蒸餾法

取上述烏藥粗粉 200.0 g裝入 1000 mL圓底燒瓶中,加蒸餾水 600 mL,連接揮發(fā)油測(cè)定器,按藥典2005版附錄 XD揮發(fā)油測(cè)定法甲法[9]操作,連續(xù)蒸餾 8 h,所得揮發(fā)油用無(wú)水硫酸鈉干燥,得到淡黃色揮發(fā)油,產(chǎn)率為 0.60%。

2.2 GC-MS分析條件

2.2.1 色譜條件

RTX-5MS石英毛細(xì)管柱 (30 m×0.25 mm× 0.25μm);色譜柱程序升溫條件:柱溫 60℃(保持 2 min),以 5℃/min升溫至 160℃(保持 5 min),再以2℃/min升溫至 200℃(保持 2 min),再以 8℃/ min升溫至 240℃,然后保持至分析完成;汽化室溫度 260℃;載氣為高純度氦氣;柱前壓 57.4 KPa;載氣流量 1.00 mL/min;進(jìn)樣量 2μL;分流比 1∶30。

2.2.2 質(zhì)譜條件

離子源為電噴霧離子源,電子能量 70 eV,離子源溫度為 200℃,質(zhì)量掃描范圍 35～400 amu。GCMS接口溫度為 260℃。

3 結(jié)果與分析

將 SFE-CO2萃取物及水蒸氣蒸餾提取揮發(fā)油分別取適量,用正己烷稀釋 100倍。經(jīng) GC-MS分析,得到 SFE-CO2萃取揮發(fā)油總離子圖 (圖 1)和水蒸氣蒸餾法提取揮發(fā)油總離子圖 (圖 2),結(jié)合計(jì)算機(jī)系統(tǒng)內(nèi)N IST27和N IST147譜庫(kù)檢索并查閱文獻(xiàn),共鑒定出 58個(gè)成分,其中超臨界 CO2萃取法揮發(fā)油被鑒定的成分有 46個(gè)(占總產(chǎn)物 91.32%),水蒸汽蒸餾法提取揮發(fā)油被鑒定的成分有 36個(gè) (占總產(chǎn)物的 92.60%),兩者共有成分 24個(gè)。應(yīng)用色譜峰面積歸一法確定各化學(xué)成分的相對(duì)含量,結(jié)果見(jiàn)表1。

表 1 超臨界 CO2萃取法與水蒸氣蒸餾法提取烏藥揮發(fā)油化學(xué)成分分析結(jié)果Table 1 Constituent of essential oil from RadixLinderae obtained by SFE-CO2and SD

8 16.25 Hexadecane(十六烷) C16H34 226 93 – 0.31 9 16.35 4-Isopropyl-1-cyclohexene-1-carbaldehyde (4-異丙基-1-環(huán)己烯-1-醛) C10H16O 152 84 0.48 –10 16.63 Bornyl acetate(龍腦乙酸酯) C12H20O2 196 97 8.31 3.14 11 18.04 .delta.-Elemene(δ-欖香烯) C15H24 204 92 – 0.41 12 19.04 .alpha-Ylangene(α-依蘭烯) C15H24 204 97 0.34 0.52 13 19.07 3-Isopropenyl-2-methylenecyclohexyl acetate (3-異丙烯基-2-亞甲基環(huán)己基乙酸酯) C12H18O2 194 86 0.94 –14 19.17 Copaene(柯巴烯) C15H24 204 94 – 0.74 15 19.58 .beta.-Elemene(β-欖香烯) C15H24 204 97 0.75 1.83 16 19.89 .alpha.-Gurjunene(α-古云烯) C15H24 204 94 0.96 0.41 17 20.41 .beta.-Caryophyllene(β-石竹烯) C15H24 204 96 – 0.43 18 20.72 .alpha.-Bergamotene(α-香檸檬烯) C15H24 204 91 – 0.34 19 20.85 .alpha.-Guaiene(α-愈創(chuàng)木烯) C15H24 204 95 0.52 0.22 20 21.64 n-Dodecanol(正十二醇) C12H26O 186 97 0.97 –21 21.78 Longifolene(長(zhǎng)葉烯) C15H24 204 93 2.84 0.32 22 21.86C15H24 204 92 – 2.07 23 22.20 Eudesma-4(14),11-diene(桉葉4(14),11-二烯) C15H24 204 91 1.64 2.57 24 22.42 .delta.-Guaiene(δ-愈創(chuàng)木烯) C15H24 204 90 2.01 2.74 25 22.46 1,1,3a-Trimethyl-7-methylenedecahydro-1 H-cyclopropa[a]naphthalene (1,1,3a-三甲基-7-亞甲基-1-H-環(huán)戊并[a]十氫萘) C15H20O 216 88 1.38 –26 22.51 .alph.a-Muurolene(α-木羅烯) C15H24 204 93 – 1.94 27 23.20 .delta.-Cadinene(δ-杜松烯) C15H24 204 91 0.97 1.81 28 23.63 .beta.-Guaiene(β-愈創(chuàng)木烯) C15H24 204 92 1.39 2.48 29 23.79 Eudesma-3,7(11)-diene(桉葉3,7(11)-二烯) C15H24 204 88 – 2.51 30 24.31 Germacrene B(大根香葉烯B) C15H24 204 91 – 0.80 31 23.93 Elemol(欖香醇) C15H26O 222 92 1.80 0.47 32 25.36 Spathulenol(斯巴醇) C15H24O 220 86 0.81 0.68 33 25.91 1-Isopropyl-4,8-dimethylspiro[4.5]dec-8-en-7-one (1-異丙基-4,8-二甲基螺[4,5]-8-癸烯-7-酮) C15H24O 220 80 0.45 –34 26.35 Selina-6-en-4-ol(蛇床-6-烯-4-醇) C15H26O 222 92 1.51 0.72 35 26.64 .gamma.-Eudes mol(γ-桉葉油醇) C15H26O 222 93 1.02 0.63 36 26.95 Agarospirol(沉香螺醇) C15H26O 222 85 – 0.75 37 27.17 4,4′-Dimethyl-2,2′-dimethylene bicyclohexyl-3,3′-diene (4,4′-二甲基-2,2′-二亞甲基雙環(huán)己基-3,3′-二烯) C16H22 214 92 23.69 8.65 38 27.41 .tau.-Cadinol(tau-杜松醇) C15H26O 222 94 4.36 1.91 39 27.89 beta.-Eudes mol(β-桉葉油醇) C15H26O 222 98 4.11 1.42 40 28.12 (9E,12E,15E)-9,12,15-Octadecatrien-1-ol [(9E,12E,15E)-9,12,15-十八三烯-1-醇] C18H32O 264 89 – 2.39 41 28.54 Tetradecyl alcohol十四醇 C14H30O 214 90 0.76 –42 29.40 n-Heptadecane(正十七烷) C17H36 240 91 – 0.52 43 29.78 10-Isopropenyl-3,7-cyclodecadien-1-one 10-異丙烯基-3,7-環(huán)癸二烯-1-酮 C13H18O 190 90 – 0.62 44 29.85 Ger macrone(吉馬酮) C15H22O 218 90 3.35 –5-Isopropenyl-3,6-dimethyl-6-vinyl-4,5,6,7-tetrahydro-1-benzofuran (5-異丙烯基-3,6-二甲基-6-乙烯基-4,5,6,7-四氫-1-苯駢呋喃) C15H24O 220 81 0.89 –46 32.88 .gamma.-Gurjunenepoxide-(2) C15H24O 220 83 – 0.92 45 30.31 6-Isopropenyl-4,8a-dimethyl-1,2,3,5,6,7,8, 8a-octahydronaphthalen-2-ol (6-異丙基-4,8a-二甲基-1,2,3,5,6,7,8,8a-八氫萘-2-醇)

47 33.12 n-Eicosane(二十烷) C20H42 282 90 0.55 0.29 48 33.23 Cyclopentanecarboxylic acid,3-isopropylidene-,bornyl ester (3-異丙烯基環(huán)戊羧酸龍腦酯) C19H30O2 290 79 1.11 –49 33.78 8-Methyl-2-phenyl-nona-4,7-dien-2-ol (8-甲基-2-苯基-4,7-二烯-2-壬醇) C16H22O 230 90 6.05 6.24 50 34.99 2-(4a,8-Dimethyl-2,3,4,4a,5,6,7,8-octahydro-2-naphthalenyl)-2-propanol(2-(4a,8-二甲基-2,3,4,4a,5,6,7,8-八氫-2-萘基)-2-丙醇) C15H26O 220 88 – 0.40 51 35.45 4-(5,5-Dimethylspiro[2.5]oct-4-yl)-2-butanone (4-(5,5-二甲基螺[2.5]-4-辛基)-2-丁酮) C14H24O 208 79 1.06 –52 35.89 2-Methyl-4-(2,6,6-trimethyl-1-cyclohexen-1-yl)butanal (2-甲基-4-(2,6,6-三甲基-1-環(huán)己烯基)正丁醛) C14H24O 208 78 2.37 –53 38.67 Heneicosane(廿一烷) C21H44 296 90 – 1.19 54 39.76 2-[2-(2,4-Dimethylphenyl)cyclopropyl]furan (2-[2-(2,4-二甲基苯基)環(huán)丙基]呋喃) C15H16O 212 93 11.61 13.35 55 41.90 n-Hexadecanoic acid(十六碳酸) C16H32O2 256 94 – 3.94 56 43.47 14,15-Didehydro-1,4,5,8,9,10,11,12,13,16,17,18,19,20-tetradecahydrocyclodeca[a]cyclotetradecene (14,15-二脫氫-1,4,5,8,9,10,11,12,13,16,17,18,19,20-十四氫環(huán)十并[a]環(huán)十四烯) C22H32 296 87 – 8.32 57 49.19 9,12-Octadecadienoic acid,methyl ester (9,12-十八碳二烯酸甲酯) C19H34O2 294 89 – 1.67 58 49.61 4,7,10,13,16,19-Docosahexaenoic acid,methyl ester, (all-Z)-(4,7,10,13,16,19-二十二碳六烯酸甲酯) C23H34O2 342 86 – 2.26

從表 1可看出,烏藥揮發(fā)油化學(xué)成分十分復(fù)雜,與文獻(xiàn)報(bào)道相差較大,這主要由于藥材產(chǎn)地、采摘時(shí)間、提取方法直接影響化學(xué)成分以及各化學(xué)成分的含量。SFE-CO2和 SD兩種方法提取的烏藥揮發(fā)油有檸檬烯、龍腦、龍腦乙酸酯、β-欖香烯、α-古云烯、桉葉 4(14),11-二烯、δ-愈創(chuàng)木烯、4,4′-二甲基-2, 2′-二亞甲基雙環(huán)己基-3,3′-二烯、tau-杜松醇、β-桉葉油醇、8-甲基-2-苯基-4,7-二烯-2-壬醇、2-[2-(2,4-二甲基苯基)環(huán)丙基 ]呋喃等 24種成分完全一致,占 SFE-CO2方法揮發(fā)油成分的 54.56%,占 SD方法揮發(fā)油成分的 78.42%。其中 SFE-CO2方法中含量較高的成分有 2-[2-(2,4-二甲基苯基)環(huán)丙基 ]呋喃(13.35%)、4,4′-二甲基-2,2′-二亞甲基雙環(huán)己基-3,3′-二烯 (8.65%)、14,15-二脫氫-1,4,5,8,9, 10,11,12,13,16,17,18,19,20-十四氫環(huán)十并[a]環(huán)十四烯 (8.32%)、8-甲基-2-苯基-4,7-二烯-2-壬醇(6.24%)、1,1-二乙氧基乙烷 (4.12%)、龍腦乙酸酯(3.14%),而 SD方法中含量較高的成分有 4,4′-二甲基-2,2′-二亞甲基雙環(huán)己基-3,3′-二烯(23.69%)、2-[2-(2,4-二甲基苯基)環(huán)丙基 ]呋喃(11.61%)龍腦乙酸酯 (8.31%)、8-甲基-2-苯基-4, 7-二烯-2-壬醇(6.05%)、tau-杜松醇 (4.36%)、β-桉葉油醇(4.11%)。

通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)分析,雖然與水蒸氣蒸餾方法相比,SFE法在低溫下進(jìn)行萃取,有利于熱不穩(wěn)定以及易氧化的揮發(fā)油物質(zhì)的提取,減少了成分的損失, SFE法得萃取物無(wú)溶劑殘留,得到的揮發(fā)油在時(shí)間和萃取率上都比 SD具有明顯優(yōu)勢(shì),但兩種方法提得的揮發(fā)油無(wú)論在成分還是其相對(duì)含量均存在一定差異。有文獻(xiàn)提出 SFE方法可替代 SD法且較 SD法優(yōu)越[12,13],本研究認(rèn)為未必如此。SFE法與 SD法得到的烏藥揮發(fā)油化學(xué)成分各有不同,研究其化學(xué)成分時(shí)必須注意這一點(diǎn)。

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