閔長莉，柴翠英

（1.皖西學院生物與制藥工程學院，安徽六安237012；2.安徽省植物生物技術(shù)實訓中心，安徽六安 237012）

蛇足石杉內(nèi)生真菌的分離與鑒定

閔長莉1，2，柴翠英1

（1.皖西學院生物與制藥工程學院，安徽六安237012；2.安徽省植物生物技術(shù)實訓中心，安徽六安 237012）

從健康蛇足石杉的莖中分離內(nèi)生真菌，用PDA培養(yǎng)基分離純化菌株，對照真菌鑒定手冊，根據(jù)菌株的菌落形態(tài)、大小、顏色、生長速率以及菌絲體和孢子的形態(tài)特征進行鑒定。從蛇足石杉的莖中分離出5株內(nèi)生真菌，經(jīng)鑒定它們分別屬于鏈格孢霉屬、鐮刀菌屬、無孢類群和青霉屬。

蛇足石杉；內(nèi)生真菌；分離；鑒定

蛇足石杉（Huperziaserrata（Thunb）.Trev.），又名千層塔、蛇足草、寶塔草等，是一種珍貴的藥用蕨類植物。在民間，蛇足石杉全草被用于治療跌打損傷、瘀血腫痛、精神分裂、肌肉痙攣、膽結(jié)石引起的劇疼等。外用可治癰疽、疥瘡，并可滅虱及臭蟲等［1］。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，蛇足石杉的活性成分石杉堿甲具有很強的抑制膽堿脂酶活性，具有提高學習記憶力和改善老年記憶功能的效果，并且對治療重癥肌無力和早老性癡呆均有顯著療效［2］。臨床上石杉堿甲已用于治療各種原因和不同年齡組的老年人記憶減退和早期老年癡呆癥，目前國際上已將石杉堿甲列為第二代乙酰膽堿酯酶抑制劑之一［3］。由于石杉堿甲在全草中含量甚微，且其結(jié)構(gòu)復雜，所以人工合成十分困難。蛇足石杉資源稀少，目前還不能人工栽培，藥品生產(chǎn)要完全依賴野生資源，必將直接影響石杉堿甲進一步的開發(fā)與利用，同時還會造成蛇足石杉資源的枯竭。因此，研究蛇足石杉中石杉堿甲資源的新來源顯得尤為重要。

植物內(nèi)生真菌（Endophytic fungi）是指生活在植物體內(nèi)或一定階段處于植物體內(nèi)，包括菌根真菌和植物病原菌［4］（P179－197）。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，植物內(nèi)生真菌能產(chǎn)生新的天然產(chǎn)物，甚至可以產(chǎn)生與宿主植物相同或相近的代謝產(chǎn)物，因而成為天然產(chǎn)物的重要來源［5］。近些年來，對藥用植物內(nèi)生真菌的研究十分活躍，人們已經(jīng)從紅豆杉屬、長春花、桃兒七、喜樹等珍貴植物中分離出能夠產(chǎn)生活性成分的內(nèi)生真菌［6－9］。本實驗主要對蛇足石杉植株內(nèi)生真菌進行了分離純化與菌種鑒定，以期為進一步研究蛇足石杉內(nèi)生真菌能否合成石杉堿甲奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料來源 蛇足石杉植株于2011年5月采自安徽天堂寨景區(qū)海拔約1100m處，經(jīng)妥善處理后帶回實驗室供試。

1.1.2 儀器與試劑 恒溫恒濕培養(yǎng)箱（PYX－150H－A，科立儀器）；電熱蒸汽壓力消毒器（YX－450，上海三申醫(yī)療器械有限公司）；潔凈工作臺（SW－CJ－1C（U），蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）。

1.1.3 培養(yǎng)基 PDA固體培養(yǎng)基：將200g新鮮的馬鈴薯洗凈去皮，切成小塊后加入適量水，煮沸1h，紗布過濾，取濾液，加入葡萄糖20g、蛋白胨2.0g、瓊脂20g，加水定容至1000mL，1.05kg／cm2高壓蒸汽滅菌30min即可。

1.2 方法

1.2.1 內(nèi)生真菌的分離方法 將所采集健康的蛇足石杉植株在自來水下洗凈后，將其莖部剪成約2cm長的小段，依次將莖置于75%乙醇表面消毒30s，無菌水沖洗3次，10%NaClO浸泡5min，無菌水沖洗3次，75%乙醇表面消毒30s，無菌水沖洗3次。在無菌的條件下，用剪刀將莖剪成0.5cm的小段。將上述材料接種到PDA固體培養(yǎng)基上，倒置于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。同時將上述消毒過程中最后一次沖洗樣品的無菌水加在培養(yǎng)基上平行培養(yǎng)，用以檢測消毒是否徹底，保障所分離到的菌株是內(nèi)生真菌。觀察樣品切口處是否有菌絲長出，待菌絲長出后，作進一步純化。

1.2.2 內(nèi)生真菌純化 2～3d后，無菌操作挑取上述樣品邊緣所長出的菌絲，劃線轉(zhuǎn)接于新的PDA平板上，進行純化培養(yǎng)，經(jīng)幾次劃線分離，得到形態(tài)完全一致的單菌落即純化的內(nèi)生真菌。觀察純化后的菌株，記錄各菌株的菌落形態(tài)、顏色、質(zhì)地及其生長速度。

1.2.3 內(nèi)生真菌的形態(tài)學鑒定 將PDA培養(yǎng)基熔化后，以每平皿15－18mL的量倒平板，凝固后將待鑒定菌種劃線接種于平板，然后取滅過菌的蓋玻片以45°角插入培養(yǎng)基內(nèi)，深度約為蓋玻片的1／3，蓋上皿蓋，于28℃培養(yǎng)，每天觀察菌落表面形態(tài)、大小、顏色、質(zhì)地、生長速度和邊緣形態(tài)；根據(jù)生長情況取出蓋玻片，在顯微鏡下觀測培養(yǎng)過程中的菌絲、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)和分生孢子梗著生情況，孢子形態(tài)與顏色等特征參考文獻［10］［11］進行鑒定。菌種于4℃冰箱保藏，每3個月復壯1次。

2 結(jié)果分析

2.1 內(nèi)生真菌分離結(jié)果

試驗以絲狀真菌為主要分離目標，經(jīng)過分離、篩選、純化的反復過程，從皖西大別山蛇足石杉的莖中共分離得到了5個純化的真菌。同期對照組中最后一次沖洗組織塊的無菌水中沒有任何菌落長出，證實分離到的5株真菌均為內(nèi)生真菌。

2.2 內(nèi)生真菌的特征與鑒定

2.2.1 WX001菌株：該菌在生長初期，菌落直徑較小，菌落初為白色，隨著培養(yǎng)時間的延長，后期變?yōu)榛揖G色，絨毛狀，邊緣較整齊；生長速度較快，在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)3d直徑達4cm左右。在顯微鏡下觀察，分生孢子梗暗色，分生孢子暗色，倒棒行，有縱橫隔。根據(jù)菌落的形態(tài)學特征對照相關(guān)的分類系統(tǒng)，初步鑒定該菌株屬于半知菌亞門絲孢目暗色孢科鏈格孢屬（Alternaria）。

2.2.2 WX002菌株：該菌株菌落表面白色，邊緣不太整齊，棉絮狀，菌絲較致密，且生長速度較慢，在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)3d直徑可達2.5cm左右，10d后直徑達6cm左右。顯微觀察可見菌絲無色有隔，大型孢子細長型，多隔。根據(jù)菌落的形態(tài)結(jié)構(gòu)及該菌的顯微特征，對照真菌鑒定手冊，初步判定該菌株為半知菌亞門瘤座孢目瘤座孢科鐮刀菌屬（Fusarium）。2.2.3 WX003菌株：該菌在生長初期，菌落直徑較小，菌落表面白色，絨毛狀，邊緣較整齊。隨著培養(yǎng)時間的延長，菌落直徑逐步變大，至培養(yǎng)3d時，可達3.6cm，且顏色變深為灰綠色。顯微鏡下可見菌絲有隔膜，分支較少，未見核，沒有孢子產(chǎn)生。根據(jù)形態(tài)學特征對照相關(guān)的分類系統(tǒng)，將該菌株初步鑒定歸屬為半知菌亞門無孢類群（Myceliasterlia）。

2.2.4 WX004菌株：該菌生長速度較慢，在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)5d后菌落直徑可達2cm左右，菌落呈青綠色絨毛狀，邊緣較整齊，菌落反面為黃色。顯微觀察可見菌落氣生菌絲發(fā)達，表面有綠色粉粒狀結(jié)構(gòu)，有橫隔，分生孢子梗不對稱分支、竹結(jié)狀，分生孢子串生于分生孢子梗頂端，分生孢子單胞、橢圓形，無色光滑。根據(jù)形態(tài)學特征對照相關(guān)的分類系統(tǒng)，將該菌株初步鑒定歸屬為半知菌亞門叢梗孢目叢梗孢科青霉屬（Penicillium）。

2.2.5 WX005菌株：該菌株生長速度較慢，在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)3d后菌落的直徑為2.3cm左右，白色絨毛狀，邊緣不太整齊，菌落反面為淡黃色。顯微鏡觀察可見菌絲無色，有隔，分枝較少，沒有孢子產(chǎn)生，根據(jù)形態(tài)學特征對照相關(guān)的分類系統(tǒng)，將該菌株初步歸屬為半知菌亞門無孢類群（Myceliasterlia）。部分內(nèi)生真菌孢子顯微圖片見圖1。

圖1 部分內(nèi)生真菌的孢子結(jié)構(gòu)（400倍）

3 討論

本實驗采用組織塊法對蛇足石杉外植體的內(nèi)生真菌進行分離純化。在實際操作過程中，內(nèi)生真菌分離所用的樣品在采集時已盡量減少污染的機會，樣品在48小時內(nèi)分離。從樣品中分離出5株真菌；同期對照組中最后一次沖洗組織塊的無菌水中沒有任何菌落長出，證實分離到的5株真菌均為蛇足石杉的內(nèi)生真菌。

5種內(nèi)生真菌分別隸屬于半知菌亞門絲孢目暗色孢科鏈格孢屬、半知菌亞門瘤座孢目瘤座孢科鐮刀菌屬、半知菌亞門叢梗孢目叢梗孢科的青霉屬和半知菌亞門無孢類群，由此可以看出，蛇足石杉植物體內(nèi)具有豐富的內(nèi)生真菌。由于本次實驗的樣品只是選取植物體的莖尖部分，對于葉、根部內(nèi)生真菌并沒有進行研究，所以有些蛇足石杉內(nèi)生真菌可能并沒有被分離出來。就蛇足石杉內(nèi)生真菌而言，今后應繼續(xù)擴大內(nèi)生真菌分離的數(shù)量和種類，并對分離的菌株能否合成石杉堿甲進行鑒定，以論證蛇足石杉內(nèi)生真菌發(fā)酵生產(chǎn)石杉堿甲的可行性。

［1］邵浩，呂會芳，張麗.石杉堿甲藥源植物研究進展［J］.上海中醫(yī)藥大學學報，2009，23（2）：83－86.

［2］余紅英，孫遠明，楊躍進.草藥蛇足石杉的研究進展［J］.中草藥，2001，32（3）：279－281.

［3］王斌，何煦昌，白東魯.老年癡呆藥物石杉堿甲類似物研究V.光學活性（－）－1－甲基石杉堿甲的合成［J］.藥學學報，1999，34（6）：434－438.

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［11］魏景超.真菌鑒定手冊［M］.上海：上海科學技術(shù)出版社，1979.

Isolation and Identification of Endophytic Fungus from Huperzia serrata

MIN Chang－li1，2，CHAI Cui－ying1

（1.CollegeofBiotechnologyandPharmaceuticalEngineering，WestAnhuiUniversity，Lu’an237012，China；2.PlantBiotechnologyTrainingCenterofAnhuiProvince，Lu’an237012，China）

In this paper，Endophytic fungi were isolated from the healthy tip stem of Huperzia serrata.The endophytic fungi were cultured in PDA medium and purified by the methods of agar plate.At the same time the endophytic fungi were identified by observing colony morphology，size，color，and the growth rate of mycelium and spores of the morphological features by comparing the Identification Handbook of Fungus.The results showed that there were five endophytic fungi species isolated from the tip stem of Huperzia serrata，which respectively belonged to Alternaria，F(xiàn)usarium，Mycelia sterlia and Penicillium.

Huperzia serrata（Thunb）.Trev.；endophytic fungi；isolation；identification

Q934.1

A

1009－9735（2011）05－0011－03

2011－10－01

國家自然科學基金項目（31100019）；安徽省高等學校省級自然科學研究項目（KJ2011B207）；皖西學院學生研究性學習項目（wxxy2011009）。

閔長莉（1975－），女，安徽霍邱人，皖西學院生物與制藥工程學院講師，碩士，研究方向：微生物藥物學。