崔麗卿,徐 瑋,汪東風

(中國海洋大學食品科學與工程學院,山東青島266003)

大菱鲆(Scophthalm usm axim us)為原產于歐洲沿海的冷水性鲆科魚類,該魚性格溫順、生長迅速、肉質鮮嫩,自1992年引入我國,大菱鲆養(yǎng)殖已覆蓋山東、江蘇、浙江和福建等省份,成為我國重要的海水養(yǎng)殖魚類[1]。然而隨著養(yǎng)殖密度的增加,水體環(huán)境的惡化,各種細菌性疾病、病毒性疾病、寄生蟲疾病時有發(fā)生[2]?？股剡@類藥物經(jīng)常用于病害的診治,但卻直接導致了耐藥菌株增加、藥物殘留等問題。而在飼料中添加免疫刺激劑[3],通過增強養(yǎng)殖動物自身免疫力來預防疾病,例如β-葡聚糖、甘露聚糖等,已被證明是1種低成本、高效、環(huán)保的預防疾病的方式。

根據(jù)國際純粹與應用化學聯(lián)合會(IUPAC)對稀土元素的定義,稀土元素是指元素周期表第三副族中原子序數(shù)從57(La)至71(Lu)的15個元素(稱為鑭系元素),再加上與其電子結構和化學性質相似的鈧(Sc)和釔(Y)。我國有豐富的稀土資源[4],由于稀土具有促生長的作用,已廣泛用于農作物、畜禽和漁業(yè)養(yǎng)殖[5-7]中。朱伯清等[8]通過在中國對蝦的飼料中添加氯化稀土,其產量增加31%,但目前為止稀土作為免疫刺激劑用于大菱鲆養(yǎng)殖中還未見報道。本實驗以大菱鲆為研究對象,通過在飼料中添加稀土,考察其對魚體生長指標、非特異免疫力和抗病力的影響,以期為大菱鲆免疫刺激劑的開發(fā)和合理應用提供基礎理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗飼料

實驗以魚粉(購自青島七好有限公司)為主要蛋白源,魚油和大豆卵磷脂為主要脂肪源,小麥粉為糖源,配制粗蛋白含量為53.01%,粗脂肪含量為12.57%,灰分含量為9.50%的基礎飼料。在基礎飼料中分別添加0、240 mg/kg的硝酸稀土,經(jīng)制粒機加工成3.0 mm顆粒狀飼料,在50℃恒溫下干燥12 h,密封保存。硝酸稀土購自河南商丘稀土微肥有限公司,經(jīng)ICP-OES(V ISTA-M PX,VARIAN)所測得到硝酸稀土中含鑭9.53%,鋱5.38%,鏑2.47%,銩1.72%,鈥1.51%,镥0.18%,即硝酸稀土中所含稀土總量為20.79%。

1.2 實驗用魚及樣品采集

實驗用大菱鲆幼魚為當年人工培育的同一批苗種。實驗在青島國家海洋科學研究中心中國海洋大學科研基地進行。實驗前,大菱鲆于300 L玻璃鋼中暫養(yǎng),使其適應養(yǎng)殖環(huán)境。實驗共設2個處理,每個處理3個重復,每桶放養(yǎng)40尾大菱鲆,每天投喂2次(7··00,18··00),采取飽食投喂。實驗周期為8周,期間24 h連續(xù)充氧。

8周生長實驗結束后,對大菱鲆饑餓24 h,然后計數(shù),稱重。分別從每桶隨機取5尾魚,用1 m L無菌注射器自尾靜脈取血,每組實驗魚所得血液均分成2份:1份加肝素鈉抗凝后用于吞噬指數(shù)的測定;1份不加抗凝劑,于4℃冰箱中靜置過夜,吸取上層血清于1.5 m L離心管中,放于-70℃冰箱中用于酶活性測定。

1.3 樣品分析測定方法

1.3.1 吞噬指數(shù)(Phagocytic index,PI)測定 將金黃色葡萄球菌接種于營養(yǎng)肉湯中,放37℃搖床中培養(yǎng)12 h左右,4 000 r·min-1離心10 min,取沉淀,用無菌生理鹽水稀釋成1.7×109cfu/m L備用。

大菱鲆自尾靜脈取血后,每毫升血液中立即添加0.2 m L肝素鈉(濃度為1 500 U/m L),輕輕搖動混勻。取100μL抗凝血,放入96孔培養(yǎng)板中,再加上述葡萄球菌菌液100μL充分混勻,37℃水浴30 min,其間每隔10 min搖勻1次。

作用完畢,取1小滴混合液置于潔凈無油污的載玻片一端,推成薄片。待干后,用Giemsa染液染色2～3 min,水洗,脫色,置油鏡下觀察。隨機計數(shù)100個參與吞噬的中性粒細胞,同時記錄所吞噬的細菌數(shù)并計算吞噬指數(shù)。

吞噬指數(shù)=Po/100

式中,Po為參與吞噬的中性粒細胞所吞噬的細菌數(shù),100為參與吞噬的中性粒細胞數(shù)目。

1.3.2 超氧化岐化酶(Super oxide dismutase,SOD)活力測定 SOD活力測定,采用從南京建成生物工程研究所購買的檢測試劑盒,相應操作參照說明書進行。其中,SOD活力按黃嘌呤氧化酶法,活力單位定義為:每mL反應液中SOD抑制率達50%所對應的SOD量為1個SOD活力單位(U/m L)。

1.4 攻毒試驗

生長試驗結束后,分別從每桶隨機選10尾魚進行攻毒實驗。用一次性注射器通過腹腔注射遲緩愛德華氏菌(Edwardsiella tarda)菌液0.2 m L/尾(菌液濃度為105cfu/mL),攻毒所用菌種由中國海洋大學生命學院提供,為大菱鲆腹水病病原菌。飼喂及飼養(yǎng)管理與飼養(yǎng)實驗期間相同,同時記錄攻毒7 d后魚的死亡率。

1.5 計算及統(tǒng)計分析

(1)成活率(%)=(No-Nt)/No×100%

(2)增重率(%)=(Wt-Wo)/Wo×100%

(3)飼料系數(shù)=F/W

(4)特定生長率(%/d)=(Ln Wt-Ln Wo)×100/t

(5)肝臟指數(shù)(%)=m1/Wt×100

(6)腎臟指數(shù)(%)=m2/Wt×100

式中,No和Nt分別為每桶初始和死亡的大菱鲆尾數(shù),Wo和Wt分別為大菱鲆的初始體重和終末體重(g),t為實驗天數(shù)(d),F為重復組飼料總攝入量,W為重復組總魚體增重,m1為每尾魚的肝臟質量(g),m2為每尾魚的腎臟質量(g)。

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0軟件進行配對樣本T檢驗,均表示為平均值±標準誤(M ean±S.E.M),以P<0.05作為差異顯著水平。

2 結果

2.1 稀土對大菱鲆增重率、特定生長率、飼料系數(shù)以及成活率的影響

稀土對大菱鲆生長的影響見表1。經(jīng)過8周飼養(yǎng)實驗后,飼料中添加稀土的大菱鲆成活率為93.7%,高于對照組(86.0%)。實驗中大菱鲆的特定生長率、增重率與成活率有相似的規(guī)律,即與對照組相比,稀土組大菱鲆特定生長率提高了15.79%,增重率提高了26.88%,而稀土組的飼料系數(shù)為0.9,顯著低于對照組(1.6)(P<0.05)。

表1 稀土對大菱鲆增重率、特定生長率、飼料系數(shù)以及成活率的影響Table 1 Effects of rare earth elements on weight gain rate,specific grow th rate,feed coefficient and survival of Scophthalm usm ax im us

2.2 稀土對大菱鲆吞噬指數(shù)、肝臟指數(shù)以及腎臟指數(shù)的影響

稀土對大菱鲆吞噬指數(shù)、肝臟指數(shù)以及腎臟指數(shù)的測定結果見表2。飼料中添加稀土的大菱鲆吞噬指數(shù)為117.2,高于對照組(114.0)。與對照組相比,稀土組大菱鲆肝臟指數(shù)提高了24.70%,腎臟指數(shù)提高了9.52%。

表2 稀土對大菱鲆吞噬指數(shù)、肝臟指數(shù)以及腎臟指數(shù)的影響Table 2 Effects of rare earth elements on phagocytic index,liver index and renal index of Scophthalmusmaxim us

2.3 稀土對大菱鲆超氧化歧化酶的影響

稀土對大菱鲆超氧化歧化酶的測定結果見圖1。飼料中添加稀土的大菱鲆SOD酶活為58.3,高于對照組(53.6)。

圖1 稀土對大菱鲆超氧化歧化酶的影響Fig.1 Effects of rare earth elements on super oxide dismutase of Scophthalmusmaximus

2.4 稀土對由遲緩愛德華氏菌所感染的大菱鲆死亡率的影響

稀土對由遲緩愛德華氏菌所感染的大菱鲆死亡率影響的測定結果見圖2。經(jīng)過7d的攻毒實驗,稀土組的死亡率低于正常組,飼料中添加稀土可以提高大菱鲆抵抗腹水病的能力。

圖2 稀土對由遲緩愛德華氏菌所感染的大菱鲆死亡率的影響Fig.2 Effects of rare earth elements on mo rtality of Scophthalm usm axim us,challenged with Echw ardsiella tarda

3 討論

本實驗中硝酸稀土的添加劑量為240 mg/kg,而硝酸稀土中所含稀土為20.79%,即飼料中稀土的有效含量為49.90 m g/kg,而中國稀土農用網(wǎng)[9]發(fā)布的:魚類飼料中的稀土以50 mg/kg為宜,兩者數(shù)據(jù)相近。經(jīng)過8周的飼養(yǎng)實驗,飼料中添加稀土后,大菱鲆的成活率提高了8.95%,而且特定生長率提高了15.79%,增重率提高了26.88%。而飼料系數(shù)降低了43.75%,這與以前的研究結果相類似。江振瑩[10]用700 g/m3稀土溶液浸泡魚體,結果鯉魚體增重16.1%,同時鯉魚的成活率也提高了。石文雷等[11]研究表明,飼料中添加Vc稀土(團頭魴36.94～42.77 mg/kg,草魚54.56～58.87 mg/kg)可促進魚體生長,降低餌料系數(shù),并且提高成活率。

吞噬能力是魚類的非特異性免疫功能的重要組成部分,當細菌等異物侵入機體時,血液中的白細胞會發(fā)揮趨化作用向其聚集,通過胞吞作用將異物吞噬。本實驗飼料中添加稀土喂養(yǎng)的大菱鲆血液中性粒細胞的吞噬指數(shù)高于對照組,實驗結果表明,稀土有效地激活大菱鲆吞噬細胞的吞噬功能,從而使其非特異性免疫力得到改善與提高。申秀英等[12]證實,中、低濃度的鈰顯著增加大鼠血液中性粒細胞的數(shù)量,并且低濃度的鈰使淋巴細胞所占白細胞的比例升高,提高了大鼠的免疫力。王宗惠等[13]研究發(fā)現(xiàn),在4～125μg/mL劑量范圍內,稀土能夠促進巨噬細胞特異吞噬功能,并呈劑量反應依賴關系。馬文強等[14]表明,補充一定量的稀土元素,可改善機體的細胞免疫和體液免疫。而有關稀土提高吞噬指數(shù)的機理,也有學者進行了相關的研究。M izgerd等[15]的研究表明,稀土能夠被巨噬細胞所吞噬從而促進細胞調亡。

SOD酶具有清除活性氧的功能,是生物體內主要抗氧化酶類之一,在防御機體衰老方面有極為重要的作用。本實驗飼料中添加稀土喂養(yǎng)的大菱鲆SOD酶活性高于對照組。稀土離子半徑較小,表現(xiàn)為硬酸性,容易與作為硬堿的氧結合[16],可以通過此機制清除活性氧?；钚匝醯臄?shù)量與殺菌力存在相關關系,是反映非特異性免疫能力的一項指標。汪承潤等[17]研究發(fā)現(xiàn),低劑量硝酸鈥可增強機體SOD、CAT、POD 3種抗氧化酶活力。Y.Chen等[18]研究表明,金魚經(jīng)過18 d La3+、Gd3+、Y3+浸浴處理后,肝臟SOD酶活的增加率分別為15.58%、16.8%和24.8%;而經(jīng)過La-ED TA、Gd-ED TA、Y-ED TA處理后,肝臟SOD酶活的增加率分別為16.4%、22.6%和35.2%。邵紅星[19]等研究發(fā)現(xiàn),在飼料中添加500m g/kg的“常樂”稀土后,鯉魚肝胰臟CA T酶活達到最大值。

攻毒實驗是免疫刺激劑效果最直觀的反映方式,遲緩愛德華氏菌[20]是大菱鲆腹水病的主要致病菌之一。攻毒實驗結果表明,攝食稀土后大菱鲆抵抗遲緩愛德華氏菌感染的能力增強,這與吞噬指數(shù)、超氧化岐化酶所反映的非特異免疫力的指標有著相似的規(guī)律。

4 結語

本研究首次研究了稀土對大菱鲆生長以及非特異性免疫力的影響。結果表明,飼料中添加稀土能促進大菱鲆生長,提高機體免疫力,增強抗病力,將其應用為大菱鲆免疫刺激劑具有廣闊的前景。但稀土在海水養(yǎng)殖方面實際應用還有待進一步研究,例如針對不同水產動物在不同的生長階段,施用的方式以及添加劑量的選擇也是不同的;稀土對水產動物免疫力影響的機理研究報道很少。

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