六種大型藻浸提液對(duì)中肋骨條藻的抑制及活性成分分離*

別聰聰,李鋒民,李媛媛,趙雅菡,王震宇

(中國(guó)海洋大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院,山東青島266100)

赤潮是1種全球性的海洋災(zāi)害[1],自2000年以來(lái),我國(guó)近海赤潮帶來(lái)約億元的直接經(jīng)濟(jì)損失[2]。目前赤潮的防治主要有人工打撈、播撒絮凝劑以及利用食物鏈除藻[3],各種方法顯示優(yōu)點(diǎn)的同時(shí)也有過(guò)度依賴人工、二次污染等缺點(diǎn)[4]。而化感作用的發(fā)現(xiàn)為赤潮的防治提供了新思路。

化感作用是指植物通過(guò)分泌次生代謝產(chǎn)物(化感物質(zhì))對(duì)其周圍的植物或微生物產(chǎn)生影響的現(xiàn)象[5-6]?；凶饔迷谵r(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中的研究較為成熟,利用其進(jìn)行作物輪作、間隙栽培等實(shí)現(xiàn)可持續(xù)發(fā)展已成為該領(lǐng)域的研究重點(diǎn)[7],但水生生態(tài)系統(tǒng)中的化感作用研究起步較晚,多處于實(shí)驗(yàn)?zāi)M階段。研究者驗(yàn)證了陸生、水生植物對(duì)微藻的化感抑制作用[8-11],其中大型藻對(duì)微藻的生長(zhǎng)影響現(xiàn)象近來(lái)受到關(guān)注,王悠等[12]發(fā)現(xiàn)大型藻石莼和江蘺完全殺死共培養(yǎng)的赤潮異彎藻,雷光英[13]發(fā)現(xiàn)龍須菜對(duì)海洋原甲藻產(chǎn)生生長(zhǎng)抑制,這些研究使得利用大型藻化感作用防治赤潮成為可能。但赤潮爆發(fā)突然、范圍大,受大型藻培養(yǎng)周期長(zhǎng)、作用范圍有限等因素的影響,利用活體大型藻防治赤潮的可行性不大,因此從大型藻中分離提取化感物質(zhì)成為理想的手段,其不僅解決了大型藻的利用問(wèn)題,而且大型藻來(lái)自海洋不易引起二次污染。

中肋骨條藻是全世界分布廣泛、我國(guó)近海發(fā)生頻率高且危害嚴(yán)重的典型赤潮藻[2,14],目前利用大型藻化感作用抑制中肋骨條藻的研究還較少見(jiàn)。因此本文選取孔石莼、羊棲菜、長(zhǎng)滸苔、蜈蚣藻、馬尾藻和裙帶菜6種常見(jiàn)大型藻,比較其干粉末的海水浸提液對(duì)中肋骨條藻的化感抑制效果,篩選出具高抑藻能力的大型藻,并進(jìn)行初步的化感物質(zhì)分離,為進(jìn)一步提取抑藻化感物質(zhì)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 大型藻 實(shí)驗(yàn)采用的6種大型藻分別為孔石莼(Ulva pertusa)、羊棲菜(Sargassum fusiforme)、長(zhǎng)滸苔(Enteromorpha clathrata)、馬尾藻(Sargassum pathen)、蜈蚣藻(Grateloupia filicina)和裙帶菜(Undaria pinnatifida),均購(gòu)自浙江一泓藻業(yè)公司,自然風(fēng)干。

1.1.2 中肋骨條藻 中肋骨條藻(Skeletonem a costatum)由中科院海洋所環(huán)境與生態(tài)實(shí)驗(yàn)室提供。采用f/2(+Si)培養(yǎng)基[15],培養(yǎng)于人工智能光照培養(yǎng)箱中(寧波,江南儀器公司),光照強(qiáng)度為4000 Lx,晝夜時(shí)間與溫度分別為12/12 h和24/20℃。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 大型藻浸提液的制備 大型藻干燥(60℃,24 h)后,研缽研磨至粒徑小于0.1 mm,粉末密封待用。取30 g海藻干粉末,浸泡于250 m L經(jīng)0.45μm孔徑的醋酸纖維膜過(guò)濾且滅菌(121℃,20 min)的海水中,于25℃恒溫箱中避光浸提48 h。浸提液經(jīng)200目篩絹過(guò)濾,濾液再經(jīng)0.45μm孔徑的醋酸纖維膜過(guò)濾,最終濾液即為大型藻浸提液母液。采用單位體積大型藻的干重表示浸提液中大型藻的濃度。

1.2.2 長(zhǎng)滸苔化感組分的萃取分離 稱取1 kg烘干(60℃,48 h)的長(zhǎng)滸苔粉末于5 L無(wú)水乙醇中室溫浸泡提取48 h后,經(jīng)200目篩過(guò)濾獲得的乙醇浸提液,用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(EYELA CCA-1110,Japan)在40℃下減壓蒸發(fā)濃縮,得到浸膏,浸膏按圖1所示步驟進(jìn)行液液萃取分離,得到4個(gè)長(zhǎng)滸苔的分離組分A、B、C和D。

圖1 長(zhǎng)滸苔中化感物質(zhì)的液液萃取分離步驟Fig.1 Extractive p roceduresof allelochemicals from E.clathrata

1.2.3 浸提液及化感組分抑藻活性檢測(cè) 取生長(zhǎng)狀況良好、處于指數(shù)增長(zhǎng)期的中肋骨條藻種液與已滅菌的海水f/2(+Si)培養(yǎng)基以1∶3(V/V)混合,充分搖勻。準(zhǔn)確移取微藻培養(yǎng)液到體積為250 mL已高溫滅菌(121℃,20 min)的錐形瓶中,并按照0,0.5,1,2,4,8 m L的體積分別移取大型藻浸提液母液于已上述藻液中,最終藻液體積為200 mL,且大型藻的濃度分別為0,0.3,0.6,1.2,2.4,4.8 g/L。實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)重復(fù)。每24 h測(cè)定中肋骨條藻的密度,根據(jù)藻的生長(zhǎng)周期,實(shí)驗(yàn)持續(xù)7 d。

大型藻浸提液的萃取分離組分均按上述步驟進(jìn)行抑制實(shí)驗(yàn)。

1.3 分析測(cè)試方法

1.3.1 數(shù)據(jù)分析 每24 h采樣1 m L,經(jīng)Lugol’s試劑固定后,用血球計(jì)數(shù)板在光學(xué)顯微鏡下(Nikon,YS-100)計(jì)數(shù)藻細(xì)胞數(shù)量的變化。通過(guò)比較6種大型藻對(duì)中肋骨條藻的抑制率IR(%)±SD和半效應(yīng)濃度EC50±SD值來(lái)評(píng)價(jià)大型藻對(duì)中肋骨條藻抑制能力強(qiáng)弱。

抑制率計(jì)算公式:IR(%)=(1-N/N0)×100%,N0為微藻單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞密度(對(duì)照組),N是投加大型藻后的微藻細(xì)胞密度(處理組)。

大型藻對(duì)微藻的半效應(yīng)濃度EC50值采用內(nèi)插直線法計(jì)算[16]。

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析使用PASW Statistics 18.0統(tǒng)計(jì)軟件完成。

1.3.2 化感組分的結(jié)構(gòu)分析 實(shí)驗(yàn)采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)Aglient2006分析化感組分的結(jié)構(gòu),其中色譜柱型號(hào)為HP-5石英毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25μm),程序升溫條件:60℃(5 min),60℃升溫至280℃(5℃/min),280℃(2 min);注射口溫度280℃。M S條件:離子源-70 ev,溶劑延遲時(shí)間4 min。

2 結(jié)果與討論

2.1 大型藻浸提液對(duì)中肋骨條藻生長(zhǎng)的影響

孔石莼、羊棲菜、長(zhǎng)滸苔、馬尾藻、蜈蚣藻和裙帶菜6種大型藻浸提液均能影響中肋骨條藻的生長(zhǎng),其生長(zhǎng)曲線的變化如圖2。6種受試海藻浸提液對(duì)中肋骨條藻的抑制率隨濃度的增大而提高,當(dāng)濃度達(dá)到1.2 g/L時(shí),長(zhǎng)滸苔對(duì)中肋骨條藻的抑制率達(dá)到50%,孔石莼、羊棲菜、長(zhǎng)滸苔、馬尾藻和蜈蚣藻的浸提液在濃度達(dá)到2.4 g/L時(shí)可在實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)使中肋骨條藻全部致死,抑制率達(dá)到100%,全部致死所需時(shí)間分別為96、120、96、144和144 h。而在大型藻濃度達(dá)到4.8 g/L時(shí),6種大型藻均可全部殺死中肋骨條藻,使微藻全部死亡的時(shí)間,孔石莼、羊棲菜、長(zhǎng)滸苔、馬尾藻、蜈蚣藻和裙帶菜分別為72、96、72、96、96、120 h,可見(jiàn)隨著大型藻濃度的增大,使中肋骨條藻全部死亡所需的時(shí)間變短。此外,在6種大型藻的低濃度(0.3 g/L)處理中,中肋骨條藻的生長(zhǎng)被輕微的促進(jìn),如微藻培養(yǎng)至72 h時(shí),長(zhǎng)滸苔的0.3 g/L的濃度處理組,中肋骨條藻的抑制率為-18%,類似的促進(jìn)中肋骨條藻生長(zhǎng)的現(xiàn)象在馬尾藻、蜈蚣藻和裙帶菜低濃度(0.3 g/L)處理中也同時(shí)出現(xiàn)。

王悠等[12]研究了新鮮石莼組織及其培養(yǎng)液濾液對(duì)赤潮異彎藻的生長(zhǎng)影響。石莼鮮組織的起始濃度愈高,其對(duì)赤潮異彎藻生長(zhǎng)的抑制作用愈明顯。而這種高濃度抑制微藻生長(zhǎng)低濃度生長(zhǎng)促進(jìn)微藻生長(zhǎng)的現(xiàn)象被成為“低促高抑”現(xiàn)象,其他研究者有類似的發(fā)現(xiàn)。南春容等[17]發(fā)現(xiàn):孔石莼浸提液濃度為2 g/L時(shí),赤潮異彎藻在2 d內(nèi)能完全被殺死,至第7天,中肋骨條藻能完全致死。但是當(dāng)處理濃度為0.25和0.50 g/L時(shí),2種微藻細(xì)胞均從第5天起也出現(xiàn)迅速增殖,至實(shí)驗(yàn)結(jié)束藻細(xì)胞密度大于對(duì)照組,表現(xiàn)為促進(jìn)效應(yīng)。

本研究表明,6種大型藻浸提液能抑制中肋骨條藻的生長(zhǎng),且濃度越大抑制效果越顯著,長(zhǎng)滸苔的抑制能力最強(qiáng),EC50值為1.0 g/L,結(jié)合抑制率曲線,2.4 g/L是其抑制中肋骨條藻赤潮的可選用的濃度。

圖2 6種大型藻浸提液對(duì)中肋骨條藻的抑制率曲線Fig.2 The inhibito ry rate curve of 6 speciesmacroalgal seawater extract on S.costatum grow th

2.2 大型藻浸取液對(duì)中肋骨條藻生長(zhǎng)的EC50值比較

采用直線內(nèi)插法計(jì)算長(zhǎng)滸苔、孔石莼、羊棲菜、馬尾藻、蜈蚣藻和裙帶菜浸提液對(duì)中肋骨條藻的EC50,120h值分別為1.0、1.0、1.1、1.4、2.5和4.7 g/L(見(jiàn)圖3)。裙帶菜的EC50值最高,為4.7 g/L,其抑制中肋骨條藻生長(zhǎng)的能力最弱。長(zhǎng)滸苔和孔石莼的EC50最低,結(jié)合抑制率結(jié)果可以看出,長(zhǎng)滸苔和孔石莼對(duì)中肋骨條藻的抑制能力最強(qiáng)。相比孔石莼,長(zhǎng)滸苔對(duì)微藻的化感抑制作用研究相對(duì)較少,因此后續(xù)的研究中選取長(zhǎng)滸苔進(jìn)行進(jìn)一步的化感組分的分離。

圖3 6種大型藻對(duì)中肋骨條藻的半效應(yīng)濃度EC50(g/L)Fig.3 The EC50(g/L)valuesof 6 speciesmacroalgae on S.costatum

半效應(yīng)濃度EC50是表征抑制劑抑制目標(biāo)生物能力的指標(biāo),EC50值越小,說(shuō)明抑制劑的抑制作用越強(qiáng)。發(fā)表的研究結(jié)果顯示不同的大型藻對(duì)不同的目標(biāo)微藻抑制能力不同,如石莼干組織對(duì)中肋骨條藻的EC50值為0.5 g/L[17],孔石莼有性株干粉末對(duì)赤潮異彎藻和塔瑪亞歷山大藻的EC50值分別為1.0、0.8 g/L[18]。與本研究相比,長(zhǎng)滸苔對(duì)中肋骨條藻的EC50值為1.0 g/L,顯示了較強(qiáng)的抑制能力。本研究中不同的大型藻的干粉末浸提液對(duì)同種赤潮藻細(xì)胞表現(xiàn)出的不同的生長(zhǎng)抑制作用(生長(zhǎng)抑制率和半效應(yīng)濃度)表明中肋骨條藻細(xì)胞對(duì)不同的大型藻有不同的敏感性。Sanna等[19]認(rèn)為1種生物體的敏感性取決于該種生物對(duì)其所暴露的化感物質(zhì)的自然屬性,同一物種可能對(duì)來(lái)源不同的化感物質(zhì)有不同的反應(yīng)。

目前大部分的研究采用浸提液、濾液[17,20]或胞外分泌物[21]進(jìn)行,但是能確定并分離到化感物質(zhì)對(duì)于進(jìn)一步研究化感作用的本質(zhì)、化感物質(zhì)的釋放、對(duì)目標(biāo)種生理生化的影響,以及化感物質(zhì)在水體中的遷移都是至關(guān)重要的,有研究者試圖進(jìn)行這樣的研究,有的能成功[22],有的卻未果[23],這也是1個(gè)制約化感作用研究的難點(diǎn)。因此,長(zhǎng)滸苔抑制中肋骨條藻的生長(zhǎng)的作用機(jī)理的深入研究以及進(jìn)一步的應(yīng)用需要更進(jìn)一步的化感物質(zhì)的提取。

2.3 長(zhǎng)滸苔化感組分對(duì)中肋骨條藻生長(zhǎng)的影響

長(zhǎng)滸苔浸提液經(jīng)液液萃取分離后得到4個(gè)化感組分A、B、C和D,其對(duì)中肋骨條藻的生長(zhǎng)影響如圖4。在培養(yǎng)3 d內(nèi),組分A最大抑制率僅為39%。對(duì)于組分B,隨濃度的增大對(duì)中肋骨條藻生長(zhǎng)的抑制率增大,濃度為0.2 mg/L時(shí),在第1天抑制率就幾乎達(dá)到了60%,至第2天,0.1、0.2、0.4 m g/L濃度處理的抑制率分別為63%、73%和84%,在第3天,0.4 mg/L處理組的抑制率分別達(dá)到96%,幾乎完全殺死了藻細(xì)胞。組分C和D在3 d培養(yǎng)中最大抑制不超過(guò)40%?？梢钥闯?組分B的抑藻效果最好。

圖4 4個(gè)液液萃取組分對(duì)中肋骨條藻生長(zhǎng)72 h的抑制率Fig.4 Inhibito ry rate curve of 4 extractive parts on S.costatum in 72 hours

4個(gè)組分對(duì)中肋骨條藻的抑制率所得EC50·72h值如表3所示,組分B的EC50最小,為0.08 mg/L。半效應(yīng)濃度值越低表明其抑制50%藻生長(zhǎng)所需濃度越低,抑藻效果越好。該結(jié)果與抑制率結(jié)果相符,組分B具有最好的抑藻效果。

表3 長(zhǎng)滸苔4個(gè)化感組分的EC50,72hTable 3 EC50,72h of 4 extractive parts on S.costatum

當(dāng)前已報(bào)道的化感物質(zhì),槐糖酯、沒(méi)食子酸抑制亞歷山大藻的EC50值大約在10～20 m g/L間[24-25],兒茶酚、對(duì)苯二酚的抑藻效果較好,其對(duì)銅綠微囊藻的EC50值分別約為0.3、0.059 mg/L[26-27]。盧慧明研究發(fā)現(xiàn)大型藻龍須菜的乙醇浸出組分對(duì)中肋骨條藻的EC50值為42 mg/L[28],但是沒(méi)有對(duì)其做進(jìn)一步的分離。本研究中組分B對(duì)中肋骨條藻的EC50值為0.08 mg/L,顯示了很強(qiáng)的抑藻活性。因此,在后續(xù)的研究中采用GC-M S分析組分B中所含物質(zhì)的結(jié)構(gòu),找出可能的起作用的化感物質(zhì)。

3.3.3 化感組分的結(jié)構(gòu)分析 為確定長(zhǎng)滸苔中抑藻化感物質(zhì)的結(jié)構(gòu),對(duì)液液萃取所得4個(gè)組分中抑藻效果顯著的組分B采用GC-M S分析其中的物質(zhì)結(jié)構(gòu),所得色譜圖如圖5所示,利用M S得到各峰對(duì)應(yīng)的化學(xué)物質(zhì)名稱如表5所示。組分B有9個(gè)色譜峰(見(jiàn)圖5),其中含量最高的3個(gè)組分以名稱(化學(xué)式,保留時(shí)間,含量)表示分別為:9-十八炔(C18H34,15.73 min,28.45%)、鄰苯二甲酸二異丁酯(C16H22O4,16.34 min,18.58%)、17-烯/十八醛(C18H36O,16.57 min,11.18%)。但是,哪種或哪幾種物質(zhì)是有效的化感物質(zhì),仍需進(jìn)一步研究。

圖5 乙酸乙酯萃取組分B的氣相峰譜圖Fig.5 GC chromatogram of the part B

表5 乙酸乙酯萃取組分B的質(zhì)譜結(jié)構(gòu)分析結(jié)果Table 5 Mass results obtained from GC-MSanalysis of the fraction B

3 結(jié)語(yǔ)

6種大型藻抑制中肋骨條藻的EC50由小到大依次為:孔石莼1.0 g/L、長(zhǎng)滸苔1.0 g/L、羊棲菜1.1 g/L、馬尾藻1.4 g/L、蜈蚣藻1.5 g/L,裙帶菜4.7 g/L。根據(jù)抑制率和半效應(yīng)濃度2個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo),孔石莼和長(zhǎng)滸苔對(duì)中肋骨條藻的抑制能力最強(qiáng),其使中肋骨條藻全部致死的浸提液濃度為2.4 g/L。對(duì)長(zhǎng)滸苔浸提液進(jìn)行了液液萃取分離,得到具有強(qiáng)抑藻活性的組分即乙酸乙酯萃取相,采用GC-M S初步分析了物質(zhì)結(jié)構(gòu),但其化感物質(zhì)還需進(jìn)一步分離和鑒定。本研究為長(zhǎng)滸苔的開(kāi)發(fā)利用和從中提取分離化感物質(zhì)進(jìn)行赤潮防治提供了科學(xué)基礎(chǔ)。

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