崔燕華，向本春

（石河子大學綠洲農作物病害防控重點實驗室，石河子832003）

新疆是全球最適合加工番茄種植的地區(qū)之一，也是我國加工番茄種植和加工的重要基地，種植面積和生產能力占全國的90%以上［1］，2009年種植面積則達到歷史最高值7500hm2［2］。

加工番茄在新疆大面積栽培時間較短，但由于加工番茄特殊的栽培措施及生長特點，病蟲害發(fā)生有種類日益增多，發(fā)病越來越重的趨勢，使加工番茄的產量及品質受到重大影響，其中病毒病害發(fā)生比較嚴重。通過近2年在新疆加工番茄主產區(qū)田間深入調查，我們發(fā)現(xiàn)在加工番茄生長中后期植株常表現(xiàn)頂端葉片黃化，且全疆各地均有發(fā)生。

高溫天氣和生理性缺素、植物病毒等可引起植物黃化［3－4］，高溫天氣和生理性缺素引起的黃化病屬于非侵染性病害，其病害分布特點與侵染性病害不同。加工番茄病毒病在田間多引起花葉、環(huán)斑、畸形、變色和壞死等癥狀［4］。變色中的黃化主要指葉片的局部或全部顏色黃化。目前，能引起番茄產生黃化的病毒主要為番茄黃化曲葉病毒（tomato yellow leaf curl virus，TYLCV）［5］、番茄侵染性褪綠病 毒 （tomato infectious chlorosis virus，TICV）［6］和 番 茄 褪 綠 病 毒 （tomato chlorosis virus，ToCV）［7］。番茄黃化曲葉病毒病的典型癥狀為植株矮化，上部葉片和新芽黃化、卷曲；番茄侵染性褪綠病毒病主要表現(xiàn)為脈間黃化，葉片從下部向上部逐漸變黃，有時老葉出現(xiàn)葉卷和壞死斑點。番茄褪綠病毒病的癥狀與番茄侵染性褪綠病毒病的癥狀相似。

加工番茄頂端黃化與普通的黃化癥狀表現(xiàn)不一致，目前尚無文獻報道。本實驗對此進行了初步的研究。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 毒源

2009年7月－2010年9月，從新疆兵團農六師軍戶農場、共青團，農七師123團、125團，農八師143團、145團、147團，農十二師三坪農場，呼圖壁縣，瑪納斯縣，石河子大學農試場，石河子大學農學院實驗站，烏蘇縣，吉木薩爾縣，和碩縣等15個地區(qū)采集加工番茄頂端黃化樣品。

1．1．2 實驗試劑

磷鎢酸、Na2HPO4、NaH2PO4、NaCO3、NaHCO3、NaCl、Tween－20、濃硫酸、鄰苯二胺等均為國產分析純；硝酸（優(yōu)級純）；30%H2O2（優(yōu)級純）；超純水（18．25MΩ．cm）；辣根酶標記山羊抗小鼠IgG購自北京博奧森生物技術有限公司；酶聯(lián)免疫板（costar 3590）購自Corning公司。

標準溶液：K、Ca、Na、Mg混合標準溶液50μg／mL，100μg／mL，200μg／mL；B、Mn、Mo、Zn混合標準溶液0．5μg／mL，1．0μg／mL；Fe單元素標準溶液5μg／mL，10μg／mL。溶液用超純水配制。

1．1．3 抗血清

番茄花葉病毒（tomato mosaic virus，ToMV）、黃瓜花葉病毒（cucumber mosaic virus，CMV）、蠶豆萎蔫病毒（broad bean wilt virus，BBWV）的單克隆抗體，ToMV和煙草花葉病毒（tobacco mosaic virus，TMV）抗體均由浙江大學生物技術研究所周雪平教授惠贈。

1．1．4 特異性引物

根據(jù)已報 道 的 TMV［8］、ToMV［2］、CMV［9］、馬鈴薯M病毒（potato virus M，PVM）、馬鈴薯S病毒（potato virus S，PVS）的外殼蛋白基因序列設計引物（表1），由上海生工公司合成。

表1 TMV、ToMV、CMV、PVM、PVS的特異性引物Tab．1Special primers of TMV，ToMV，CMV，PVM and PVS

1．2 方法

1．2．1 田間調查與采樣

從新疆加工番茄主產區(qū)農六師軍戶農場、共青團農場，農七師123團、125團，農八師143團、145團、147團，農十二師三坪農場，呼圖壁縣，瑪納斯縣，石河子大學農試場，石河子大學農學院實驗站，烏蘇縣，吉木薩爾縣，和碩縣等地采集表現(xiàn)正常及頂端黃化植株樣品，并進行田間癥狀、分布特點、發(fā)病率的調查。

1．2．2 頂端葉片元素含量測定

選取農八師147團17連，農七師143團11連，石河子大學農試場4連，石河子大學農學院實驗站的正常植株及表現(xiàn)頂端黃化植株的頂端葉片進行K、Ca、Na、Mg、B、Fe、Mn、Mo、Zn元素含量測定，每個樣品設4個重復。

樣品前處理參考諸堃等［10］的方法：在105℃殺青30min，75℃下烘2－3d后室溫儲存?zhèn)溆谩?/p>

微波消解［11］：稱取0．5～1．0g處理后的番茄樣品于消化罐，加入8mL硝酸和3mL 30%H2O2，置于微波消解爐內（空白對照只加入8mL硝酸和3 mL 30%H2O2），于功率1500W 下消化40min。微波爐上趕酸，冷卻后定容至50mL，用電感耦合等離子發(fā)射光譜儀測定元素含量，每個樣品測定3次。

1．2．3 田間樣品病毒提純及病毒粒子電鏡觀察

參考并改進周雪平等［12］的方法：取150g新采集的田間樣品加300mL 0．2mol／L pH 7．2的磷酸緩沖液（含0．005mol／L EDTA，1%巰基乙醇）勻漿，濾液中加入30%（W／W）氯仿，振蕩15min后，5000r／min離心20min；上清液中加入6%（W／V）PEG－6000和0．25mol／L NaCl，4 ℃下攪拌溶解4 h，冰箱中放3～4h，5800r／min離心30min；沉淀用上述磷酸緩沖液懸浮，4℃攪拌30min；6000r／min離心15min；上清液在超速離心機中4℃下35000r／min離心2h，沉淀重新懸浮后，6000r／min離心15min。上清液即為病毒粒子粗提液。提純的病毒粗提液用1%磷鎢酸負染后，透射電鏡觀察［13］。

1．2．4 間接酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測定田間樣品

采用間接ELISA方法，用稀釋的待測抗原包被微量反應板16～18h，封閉后，加適量稀釋的被測抗原的抗體 ToMV（1∶10000）、CMV（1∶5000）、BBWV（1∶3000）單克隆抗體，ToMV 和 TMV（1∶5000）抗體0．1mL，反應后再加適當濃度的酶標抗體，經TMB底物反應顯色，加2mol／L硫酸終止。然后在BIO－RAO Model 550酶聯(lián)免疫檢測儀上，于490nm處，以空白對照孔調零后測各孔OD值［14－15］。將待測樣品OD值與陰性對照OD值進行比較 ：（P／N）＜1．5視為陰性；1．5≤P／N＜2．1視為可疑；P／N≥2．1視為陽性（染病）；P／N＞5視為強陽性［16］。每個樣品設3個重復。

1．2．5 病毒總RNA的提取

病毒總RNA的提取采用改良的LiCl方法進行［17］。

1．2．6 cDNA的合成

cDNA反轉錄在25μL體系中進行。取植物總RNA 8μL、R9隨機引物（或 M4T）2μL、10mmol／L dNTP 4μL、buffer 4μL、RNasin inhinbitor 1 μL。將以上試劑混合后室溫放置30min后加入1 μL M－MLV （200U／μL）反轉錄酶，42 ℃孵育60 min，72℃10min，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1．2．7 PCR擴增

PCR反應在25μL體系中進行。體系如下：10×buffer 2．5μL、2．5mmol／L dNTP 1．0μL、10 μmol／L上游引物和下游引物各1．0μL、cDNA模板0．5μL、Taq DNA 聚合酶（2U／μL）0．25μL、ddH2O 18．25μL，混合后于PCR儀上完成PCR反應，反應結束后將PCR產物保存在4℃?zhèn)溆?。TMV和PVM的擴增程序為94℃預變性4min；94℃變性45s；50℃退火35s；72℃延伸45s，30個循環(huán)后72℃繼續(xù)延伸10min。ToMV和CMV的擴增程序為94℃預變性4min；94℃變性45s；52℃退火45s；72℃延伸50s，30個循環(huán)后72℃繼續(xù)延伸10min。PVS的擴增程序為94℃預變性4min；94℃變性45s；55℃退火35s；72℃延伸30s，30個循環(huán)后72℃繼續(xù)延伸10min。PCR產物經1．0%瓊脂糖凝膠電泳后觀察。

圖1 加工番茄頂端黃化癥狀Fig．1Top－yellowing of infected processing tomato

圖2 加工番茄頂端黃化病毒粗提液的電鏡照片F(xiàn)ig．2The electron micrograph of virus preparation from top－yellowing of processing tomato

2 結果與分析

2．1 加工番茄頂端黃化病田間分布及發(fā)病率

2009－2010年的新疆加工番茄主產區(qū)的田間調查結果見2。加工番茄頂端黃化在全疆各地均有發(fā)生，癥狀基本一致，均是植株頂端出現(xiàn)黃化，而中、下部葉片表現(xiàn)正常（圖1），田間呈隨機分布狀。不同地塊和不同時間調查發(fā)現(xiàn)，加工番茄頂端黃化發(fā)生于7月下旬，直到果實采收。隨著時間推移，發(fā)病率逐漸增加。發(fā)病率多為2%～50%。加工番茄品種內均有發(fā)病，但無明顯差異。

表2 新疆加工番茄頂端黃化田間分布及發(fā)病率Tab．2The field distribution and incidence of top－yellowing of processing tomato in Xinjiang

2．2 樣品中9種元素含量測定

通過微波消解、電感耦合等離子體發(fā)射光譜法檢測了加工番茄頂端黃化樣品及同一田塊正常植株樣品中9種元素的含量。結果顯示，田間感病植株中B、K、Mo、Na、Zn的含量明顯高于同一田塊的正常葉片，而 Mg、Mn的含量（μg／g）稍微低于同一田塊的正常葉片（表3、表4）。RSD為0．2539%～4．0752%。

2．3 病毒的提純及電鏡觀察結果

觀察結果（圖2）顯示：在田間頂端黃化植株中既存在粒子長度為300nm左右的病毒，又有長度為700 nm左右和超過1000nm的病毒存在，這表明加工番茄頂端黃化樣品中存在多種病毒粒子。

2．4 間接酶聯(lián)免疫吸附法測定田間樣品

利用TMV、ToMV、CMV、BBWV的抗體對田間表現(xiàn)頂端黃化樣品進行了ELISA檢測，檢測結果表明：30個樣品中有29個樣品呈陽性含有ToMV病毒，可能含有ToMV病毒的樣品1個（P／N為2．022＞1．5），其中P／N＞5的強陽性樣品7個，檢測率為96．7%；30個樣品均帶有CMV病毒，強陽性樣品7個，檢測率為100%；20個樣品帶有TMV病毒，檢測率為66．7%；21個樣品帶有BBWV病毒，P／N＞1．5的可能含有BBWV病毒的樣品9個，4個為強陽性樣品，檢測率為70．0%（表5）。

表3 加工番茄頂端黃化植株與正常植株頂端葉片中9種元素含量測定Tab．3The content detection of nine elements in processing tomato with top－yellowing and normal plants

表4 加工番茄頂端黃化植株與正常植株頂端葉片中9種元素含量測定Tab．4The content detection of nine elements in processing tomato with top－yellowing and normal plants

表5 田間樣品ELISA檢測結果Tab．5ELISA detection of processing tomato samples with top－yellowing

續(xù)表5

2．5 田間樣品RT－PCR檢測

提取石河子大學農試場站4連田間頂端黃化番茄樣品的總RNA，利用TMV（圖3）、ToMV（圖4）、CMV（圖5）、PVS（圖6）、PVM（圖7）等的特異性引物進行RT－PCR，獲得了與預期目標同樣大小的片段。

圖3 引物對TA／TB的RT－PCR擴增產物凝膠電泳圖Fig．3The agrose gel eletrophoresis of RT－PCR products of the TA／TB primer

圖4 引物對To1／To2的RT－PCR擴增產物凝膠電泳圖Fig．4The agrose gel eletrophoresis of RT－PCR products of the To1／To2primer

圖5 引物對C1／C2的RT－PCR擴增產物凝膠電泳圖Fig．5The agrose gel eletrophoresis of RT－PCR of the C1／C2primer

圖6 引物對PVS－F／R的RT－PCR擴增產物凝膠電泳圖Fig．6The agrose gel eletrophoresis of RT－PCR products products of thePVS－R／L primer

圖7 引物對PVM－F／R的RT－PCR擴增產物凝膠電泳圖Fig．7The agrose gel eletrophoresis of RT－PCR products of thePVM－R／L primer

3 討論與結論

1）2009－2010年對呼圖壁縣、瑪納斯縣、石河子市周邊、烏蘇縣、奎屯市周邊、吉木薩爾縣、和碩縣等新疆加工番茄主產區(qū)進行的廣泛調查，初步明確了加工番茄頂端黃化在新疆廣泛發(fā)生，癥狀表現(xiàn)一致，田間隨機分布，但發(fā)病率和發(fā)病程度有一定差異，但在品種、栽培方式上無明顯差異。

2）利用微波消解、電感耦合等離子體發(fā)射光譜法對表現(xiàn)頂端黃化植株和正常植株頂端葉片中9種元素含量測定的結果表明田間感病植株除Mg、Mn元素稍微偏低外，其他如B、K、Mo、Na、Zn的含量都明顯高于同一田塊的正常葉片。加工番茄頂端黃化的發(fā)病率不高，同時在田間隨機分布。且據(jù)報道高溫天氣和生理性缺素引起的黃化病屬于非侵染性病害［3］，在田間大面積發(fā)生，無發(fā)病中心。因此，初步認為加工番茄頂端黃化并非由生理性缺素引起。

3）利用電鏡觀察、ELISA和RT－PCR擴增法均證明頂端黃化樣品中有多種病毒的存在。許多文獻報道，多種病毒能危害加工番茄，且有些病毒也能引起黃化，雖然這些黃化與番茄頂端黃化有所不同，但本研究確實證明在頂端黃化葉片中有病毒存在。因此，初步認為這種黃化可能與病毒有關，但這些病毒中哪一種病毒引起加工番茄頂端黃化，或者這些病毒是否通過混合感染引起黃化還有待于進一步研究。

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