彭強，班謙，賈斌，李洪濤

（石河子大學動物科技學院，石河子832003）

Zfy基因是睪丸決定因子（testis－determining facter，TDF）的候選基因［1］，其編碼的鋅指蛋白與核酸結合有關，在早期胚胎性別決定中起著重要作用［2－3］。Zfy基因位于 Y 染色體短臂（Yp11．3）上，有11個外顯子和1個隨機重復區(qū)域的13個“鋅－指”結構［4］，有約801個氨基酸，30個氨基酸殘基，由2個半胱氨酸和2個組氨酸配位1個鋅離子構成［5］。其具有2個核定位信號區(qū)和DNA結合位點，能夠特異性的與靶基因結合，引導靶基因穿過核膜，定位于精子細胞核內，其編碼蛋白可能作為轉錄因子，在精子形成過程中具有一定功能［6］，與精子的發(fā)生有關［7］。Zfy基因是繼SRY基因之后的又一睪丸決定因子。

RNA干擾（RNA interference，RNAi）是一種轉錄后水平的基因沉默 （post－transcriptional gene Silencing，PTGS）現(xiàn)象，能夠高效、特異的阻斷體內特定基因的表達，引起轉錄后同源mRNA的降解［8］。該現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)及其在生物學上的應用具有劃時代的意義，其快速、簡潔、特異性強的優(yōu)點，使其一出現(xiàn)就受到科研工作者的青睞。目前關于RNAi的作用原理已經初步認清［9－10］，且有機體可以利用RNAi來抵御病毒及其它外來核酸的侵入［11］。RNAi可成為基因功能分析和基因治療的一種有效工具，用來抑制特定基因的表達。

RNAi技術的出現(xiàn)和迅速發(fā)展為我們探究Zfy基因的功能提供了新手段。本研究根據(jù)Zfy基因的特點，構建了2個以小鼠Zfy基因為靶點的siRNA干 涉 載 體 pSilencer5．1／Zfy225 及 pSilencer5．1／Zfy2122，

利用RNAi方法干擾生精過程中Zfy基因的表達，達到限制甚至損害Y精子的結構或功能發(fā)育，再進行受精，進而達到人為影響后代性別的目的，同時也為研究性別控制提供了一個新的思路。

1 材料與方法

1．1 材料

選取8周齡健康的雄性昆明小白鼠32只，購自石河子大學實驗動物中心。實驗所用的小鼠均飼養(yǎng)在定期滅菌的控溫鼠房，自由采食和飲水。經檢測所有試驗小鼠的繁殖性能良好。

1．2 方法

1．2．1 Zfy基因RNAi重組載體構建與體外驗證

設計Zfy基因的RNAi靶序列，通過BLAST分析以及siRNA相關設計原則［12］，篩選出了2條siRNA。分別在5′和3′端引入限制性內切酶BamHI和HindIII的酶切位點，合成發(fā)夾狀RNA（short hairpin RNA，shRNA）寡核苷酸鏈及其互補鏈（表1）。

分別將Zfy225與Zfy2122的上下游合鏈，再連入經BamHI和HindIII（TaKaRa公司）雙酶切的pSilencer5．1－H1Retro載體（Ambion上海吉泰生物工程有限公司），構建成siRNA表達載體pSilencer5．1／Zfy 225（簡稱p225），pSilencer5．1／Zfy2122（簡稱p2122），并轉化到E．coli Top 10感受態(tài)細胞（北京天根生化有限公司）中，用質粒DNA提取試劑盒（北京天根生化有限公司）按說明書操作提取質粒，經EcoR I和Hind III雙酶切鑒定重組質粒后，送生物技術有限公司測序。

經體外細胞水平上的驗證表明，siRNA表達載體介導的RNAi技術，能特異性抑制小鼠生精細胞中Zfy基因的表達。

表1 shRNA寡核苷酸序列Tab．1The oligo sequence for shRNA template

1．2．2 Zfy基因體內RNAi試驗

1．2．2．1 Zfy基因RNAi片段的導入

通過前期試驗摸索體內RNA干擾的最佳條件，確定采用睪丸局部注射質粒40mg／次導入小鼠體內。將32只雄鼠隨機分成4組（每組8只），試驗I組、II組分別注射重組質粒p225與p2122，陰性對照組注射空載體pSilencer5．1－H1Retro作為對照組?？瞻讓φ战M注射同等體積的生理鹽水。間隔10d注射1次，連續(xù)注射4次，最后1次注射17d后，將各組的雄鼠處死，迅速取出睪丸組織放入液氮速凍保存。

1．2．2．2 qRT－PCR測定睪丸Zfy基因 mRNA 豐度檢測

采用 Trizol（美國Invitrogen）法提取睪丸RNA，進行反轉錄。反轉錄總反應體積為20μL，體系為：2μg總 RNA、0．5mmol／L dNTP 和 5 μmol隨機引物，在75℃下變性5min，隨后立即置冰上冷卻，再加入20URNA酶抑制劑（RNase inhibitor）、10U 反轉錄酶（AMV RTase）、4．0μL 5×RT Buffer，42℃反應60min，最后在95℃下變性5 min。利用熒光實時定量（stratagene，MX3000P）PCR方法檢測Zfy基因的mRNA表達水平，所用引物信息見表2。

PCR反應體系的總體積為25．0μL，其中含12．5μL SYBR＠ Premix Ex TaqTM（2×）（大連寶生物），上下游引物（10．0μmol／L ）各0．5μL，2．0 μL cDNA模板，加ddH2O至終體積。反應程序為：95℃ 預變性30s，95℃變性5s，退火15s（退火溫度見表2），72℃延伸15s，40個循環(huán)。試驗對所有樣本進行3個重復測定，并在每次試驗時設陰性對照。將克隆有目的片斷的質粒進行梯度稀釋后作為標準品，制作標準曲線。

表2 目的基因引物序列及PCR條件Tab．2Conditions of PCR and parameters of oligonucleotide primer pair

1．3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

采用相對定量解析的雙標準曲線法，以Gapdh為內標基因進行標準化，統(tǒng)計分析定量檢測結果。所得數(shù)據(jù)利用SPSS 13．0統(tǒng)計軟件，均為平均數(shù)±標準誤（ˉχ±SE），單因子方差分析（one－way ANOVA，LSD）檢驗實驗結果的差異顯著性，并進行多重比較。

2 結果與分析

利用qRT－PCR檢測經RNAi后試驗組與注射生理鹽水與空載體的對照組Zfy mRNA的表達水平。結果顯示：注射重組載體p2122，Zfy基因mRNA表達水平極顯著低于對照組（P＜0．01）；注射重組載體p225，Zfy基因mRNA表達水平顯著低于對照組（P＜0．05）。重組載體p2122組與p225組之間差異顯著（P＜0．05）（圖1）。

圖1 Zfy基因mRNA表達情況Fig．1The mRNA expression level of Zfy gene

3 討論

Vergnaud等［13］發(fā)現(xiàn)并克隆了Zfy基因，Page等［14］明確指出Zfy基因與性別分化、精子發(fā)生有關，在X染色體上存在其同源序列Zfx。Zfy基因是Y染色體短臂上特異性單拷貝序列，一直以來人們針對Zfy／Zfy基因的特異性進行性別鑒定［15－16］。王晗等［17］根據(jù)小鼠的Zfy／Zfy 基因設計PCR引物，將2－細胞、4－細胞、8－細胞和16細胞胚胎采用微量細胞樣品經PCR擴增，鑒定胚胎的性別，經核型分析表明鑒定胚胎的準確率達到95．2%（20／21）。于萍等［18］用巢式 PCR 擴增母體血漿中胎兒游離DNA的Zfy基因，進行產前診斷，準確率為84．8%（39／46）。徐艷春等［19］利用哺乳動物的毛發(fā)作為材料提取DNA，擴增Zfy／Zfy基因，隨機選取8種動物進行性別鑒定，得到的結果與表型完全一致。另外根據(jù)Zfy基因具有高度保守性的特點，毛德才等［20］、金梅等［21］擴增第11外顯子并測序，分析物種之間的進化關系。Reynolds等［7］還指出Zfy基因與精子發(fā)生相關。本文利用RNAi技術結合RT－PCR的方法探討小鼠生精過程中Zfy基因的功能，結果可為受精前進行性別控制奠定基礎。

目前普遍認為性別決定過程可能是以SRY基因為主導，在胚胎發(fā)育的特定階段，由一系列上游或下游基因參與和協(xié)調的級聯(lián)反應，最終完成雄性性別分化的過程［22－23］。趙 金 紅 等［24］利 用 RNAi的 方法抑制雄性胚胎SRY基因的表達，抑制率達到85%。由于SRY基因只能引導雄性性別的分化，即使干擾了SRY基因，胚胎的性別不一定會向著雌性分化，可能會產生性別畸形。因此本文采用RNAi技術干擾與精子發(fā)生相關的特異性基因Zfy，在精子形成過程中限制或損壞Y精子的功能發(fā)育，使更多的X精子獲得受精的機會，從而產生雌性后代。

Zinmemann等［25］將載脂蛋白基因的siRNAs包裹入微脂膠囊中，通過單注射導入獼猴體內，RNAi效果持續(xù)了11d。據(jù)報道小鼠的生精上皮周期是8．6d［26］，他們將再發(fā)育成具有受精能力的精子，需要約8d，即從精原干細胞開始分化到精子完全成熟需要16．6d。本研究考慮到siRNAs在體內穩(wěn)定存在的時間以及精子成熟時間，采取間隔10d注射1次，共注射4次，最后1次注射17d后，即從第1次注射到最后采集睪丸組織，共計47d。從而盡可能保證雄鼠睪丸附睪中的絕大部分精液在Zfy基因干擾過程中產生。本研究的后部分試驗正在進行中，將已經干擾Zfy基因的雄鼠與雌鼠交配，觀察其后代性別比例，可為研究Zfy基因在小鼠生精過程中的作用及其對動物性別的影響的進一步研究奠定基礎。

［1］Ao A，F(xiàn)rickson R P，Winston R，et al．Transcription of paternal Y linked genes in the human zygote as early as the prenudeate stage［J］．Zygote，1994，2（4）：281．

［2］Nagamine C M，Chan K M，Kozak C A，et al．Chromosome mapping and expression of a putative testis－determining gene in mouse［J］．Science，1989，2434（4887）：80－83．

［3］Mardon G，Page D C．The sex－determining region of the mouse Y chromosome encodes a protein with a highly acidic domain and 13zinc fingers［J］．Cell，1989，56：765－770．

［4］Palmer M S，Berta P，Sinelair A H，et al Comparison of human ZFY and ZFX ixanseripts［J］．Proc Natl Acad Sci USA，1990，87（5）：1681－1685．

［5］Brown R S，Sander C，Argos P．The primary structure of transcription factor TFⅢA has 12consecutive repeats［J］．FEBS Lett，1985，186（2）：271－274．

［6］楊增明，孫青原，夏國良．生殖生物學［M］．1版．科學出版社，2005：53－54．

［7］Reynolds R，Varlaro J．Gender determination of forensic samples using PCR amplification of ZFY／ZFXgene sequence［J］．Forensic Sci，1996，41（2）：276－286．

［8］張定校，樊斌，劉榜，等．RNA干涉（RNAi）技術應用于哺乳動物細胞的研究策略［J］．遺傳，2005，27（5）：839－844．

［9］McManus M T，Sharp P A．Gene silencing in mammals by small interfering RNAs［J］．Nat Rev Genet，2002，3（10）：737－747．

［10］張利生，陳大元．RNA干涉及其應用前景［J］．遺傳，2003，25（3）：341－344．

［11］Bosher J M，Labouesse M．RNA interference：genetic wand and genetic watchdog［J］．Mature Cell Biology，2000，2：31－36．

［12］許德暉，黃辰，劉利英，等．高效siRNA設計的研究進展［J］．遺傳，2006，28（11）：1457－1461．

［13］Vergnaud G，Page D C，Simmler M C，et al．A deletion map of the human Y chromosome based on DNA hybridization［J］．Am J Hum Genet，1986，38（2）：109－124．

［14］Page D C，Mosher R，Simpson E M，et al．The sex－determining region of the human Y chromosome encodes a finger protein［J］．Cell，1987，51（6）：1091－1104．

［15］Virta J，Markola J，Peippo J，et a1．Sex determination of bovine embryo blastomeres by fluorogenie probes［J］．Theriogenology，2002，57：2229－2236．

［16］Hasler J F，Cardey E，Stokes J E，et a1．Noneleetrophoretic PCR－sexing of bovine embryos in a commercial environment［J］．Theriogenology，2002，8（5）：1－13．

［17］王晗，竇忠英．應用巢式及復合PCR對小鼠早期胚胎進行性別鑒定［J］．西北農業(yè)學報，2005，14（4）：158－161，165．

［18］于萍，周寧．巢式PCR擴增孕婦血漿中胎兒ZFY基因的研究［J］．軍醫(yī)進修學院學報，2005，26（1）：30－32．

［19］徐艷春，馬立新，白素英，等．應用PCR方法通過毛發(fā)進行哺乳動物性別鑒定［J］．東北林業(yè)大學學報，2000，28（6）：72－77．

［20］毛德才，徐亞歐，熊勇，等．牦牛與其他物種ZFX／ZFY基因片段間的進化關系［J］．中國生物化學與分子生物學報，2007，23（6）：450－456．

［21］金梅，傅忠揚，欒嬡嬡，等．遼寧新品系絨山羊ZFX、ZFY基因片段的進化研究與性別鑒定［J］．畜牧獸醫(yī)學報，2006，37（6），530－536．

［22］Harley V R，Arkson M J，Gentaro A．The molecular action and regulation of the testis determining factors，SRY and Sox9［J］．Endocrine Reviews，2003，24（4）：466－487．

［23］Amanda S，Robin L B．Mammalian sex determination：a molecular drama［J］．Genes ＆ Development，1999，13（7）：755－767．

［24］趙金紅，杜衛(wèi)華，道爾吉，等．小鼠胚胎Sry基因的RNA干涉研究［J］．生物化學與生物物理進展，2006，33（9）：890－894．

［25］Zimmermann T S，Lee A C H，Akinc A，et al．RNAi mediated gene silencing in non－h(huán)uman primates［J］．Nature，2006，441（7089）：111－114．

［26］楊增明，孫青原，夏國良．生殖生物學［M］．1版．北京：科學出版社，2005：36．