孫 鵬, 尤 鋒 李 軍 宋宗城, 張培軍

(1. 中國(guó)科學(xué)院 海洋研究所 實(shí)驗(yàn)海洋生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 山東 青島 266071; 2. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院 東海水產(chǎn)研究所 農(nóng)業(yè)部海洋與河口漁業(yè)資源及生態(tài)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室, 上海 200090; 3. 威海圣航水產(chǎn)科技有限公司, 山東 威海 264200)

對(duì)照組和雌核發(fā)育牙鲆血清中睪酮與雌二醇水平的比較

孫 鵬1,2, 尤 鋒1, 李 軍1, 宋宗城3, 張培軍1

(1. 中國(guó)科學(xué)院 海洋研究所 實(shí)驗(yàn)海洋生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 山東 青島 266071; 2. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院 東海水產(chǎn)研究所 農(nóng)業(yè)部海洋與河口漁業(yè)資源及生態(tài)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室, 上海 200090; 3. 威海圣航水產(chǎn)科技有限公司, 山東 威海 264200)

采用放射性免疫方法測(cè)定和比較了人工誘導(dǎo)的雌核發(fā)育牙鲆(Paralichthys olivaceus)與對(duì)照組牙鲆血清中睪酮(T)和雌二醇(E2)水平。研究發(fā)現(xiàn), 雌核發(fā)育牙鲆個(gè)體中的T含量顯著高于對(duì)照組牙鲆個(gè)體(P＜0.05), 而其 E2含量則略低于對(duì)照組個(gè)體; 在雌核發(fā)育牙鲆中, 卵巢發(fā)育不正常的個(gè)體比發(fā)育正常的個(gè)體中的T含量稍高, 而E2含量則顯著低于正常雌核發(fā)育牙鲆個(gè)體和對(duì)照組牙鲆個(gè)體(P＜ 0.05)。可以推測(cè), 雌核發(fā)育牙鲆和對(duì)照組牙鲆體內(nèi)T和E2水平存在差異, 且雌核發(fā)育牙鲆中卵巢發(fā)育正常與不正常的個(gè)體之間T和E2也存在差異, 而這種差異可能導(dǎo)致了雌核發(fā)育牙鲆部分個(gè)體卵巢發(fā)育異常。本研究將為正常二倍體及雌核發(fā)育牙鲆性腺發(fā)育和內(nèi)分泌學(xué)研究提供信息支持。

牙鲆(Paralichthys olivaceus); 雌核發(fā)育; 卵巢; T; E2

魚類雌核發(fā)育是單性生殖的一種, 它是指卵子經(jīng)過精子激活后正常進(jìn)行胚胎發(fā)育, 但是卵原核并未與精原核融合, 而單獨(dú)由卵核發(fā)育成個(gè)體的生殖現(xiàn)象。在人工雌核發(fā)育誘導(dǎo)時(shí), 精子經(jīng)過遺傳物質(zhì)滅活但仍有激活卵子正常發(fā)育的能力, 將其與正常卵子受精后, 通過抑制卵裂或者第二極體的排放而分別產(chǎn)生同質(zhì)和異質(zhì)雌核發(fā)育二倍體[1]。人工誘導(dǎo)雌核發(fā)育技術(shù)是20世紀(jì)50年代后期首先從國(guó)外發(fā)展起來的, 70年代末期, 我國(guó)也開始了這一領(lǐng)域的研究。目前, 國(guó)內(nèi)外學(xué)者通過人工誘導(dǎo)雌核發(fā)育, 已經(jīng)成功培育了虹鱒(Oncorhynchus mykiss)、牙鲆(Paralichthys olivaceus)、漠斑牙鲆(Paralichthys lethostigma)、庸鰈(Hippoglossus hippoglossus)、舌齒鱸(Dicentrarchus labraxL.)、大菱鲆(Scophthalmus maximus)等多種經(jīng)濟(jì)魚類的克隆品系[2], 為養(yǎng)殖新品種的開發(fā)以及性別決定、單性生殖等生物學(xué)研究提供了寶貴的素材。

牙鲆雌性個(gè)體較雄性個(gè)體生長(zhǎng)快, 培育全雌牙鲆可以縮短養(yǎng)殖周期, 增加經(jīng)濟(jì)效益。其染色體性別類型推測(cè)為XX-XY型, 故通過人工雌核發(fā)育技術(shù)可以誘導(dǎo)出100%的XX遺傳型的牙鲆個(gè)體[3]。目前, 對(duì)于雌核發(fā)育牙鲆的誘導(dǎo)和性腺分化發(fā)育已有研究報(bào)道[1,4-5], 而對(duì)于其性類固醇激素水平方面還未見報(bào)道。眾所周知, 性類固醇激素在性腺發(fā)育過程中起著極其重要的作用[6-7], 本研究通過對(duì)課題組誘導(dǎo)培育的雌核發(fā)育牙鲆進(jìn)行抽血和解剖觀察, 測(cè)定和比較了雌核發(fā)育和普通牙鲆個(gè)體以及雌核發(fā)育群體中性腺異常和性腺正常個(gè)體之間的睪酮(T)和雌二醇(E2)水平, 以期從內(nèi)分泌學(xué)角度解釋其性腺發(fā)育異常的原因, 并為今后全雌牙鲆培育提供組織學(xué)和內(nèi)分泌學(xué)方面的參考。

1 材料與方法

1.1 材料及樣品的采集

本研究所選取樣品為2007年4月誘導(dǎo)獲得、并經(jīng)過兩年多培育的雌核發(fā)育牙鲆成魚。雌核發(fā)育誘導(dǎo)方法和條件為：將經(jīng)紫外線照射(劑量為 3.6×10-3J/mm2)的牙鲆精子與正常卵受精, 受精后 5 min, 實(shí)施冷休克處理, 處理時(shí)間 45 min, 處理水溫 0～2℃,處理后過渡到 15℃海水中進(jìn)行孵化。魚苗、苗種和成魚培育采用常規(guī)方法。

2009年 2月, 隨機(jī)選取其中 12尾(平均全長(zhǎng)為28.7 cm±4.2 cm), 進(jìn)行靜脈取血, 之后進(jìn)行解剖, 取其性腺進(jìn)行觀察和記錄。同時(shí), 選取6尾同期培育的普通牙鲆個(gè)體, 進(jìn)行抽血、解剖觀察作為對(duì)照。所取血液于常溫下放置4～6 h, 然后在8 000 r/min下離心12 min,取上層血清, 儲(chǔ)存于-20℃待測(cè)。

1.2 性腺樣品的組織切片

所取性腺樣品于Bouin’s液中固定24 h, 然后轉(zhuǎn)入70%乙醇中保存。固定的樣品用石蠟包埋, 做連續(xù)切片, 切片厚度 5～6 μm, H.E.染色, 用 Nikon 顯微鏡觀察, 并拍照記錄。

1.3 血清中T與E2含量的測(cè)定

上述獲得的雌核發(fā)育和對(duì)照組牙鲆的血清樣品用于T與E2含量的測(cè)定。T和E2測(cè)定所需的放射免疫測(cè)定試劑盒購(gòu)自濰坊三維生物工程集團(tuán)有限公司, E2的測(cè)定靈敏度為 1.1 pg/mL, 批內(nèi)變異系數(shù)≤10%, 批間變異系數(shù)≤10%。T的測(cè)定靈敏度為0.05 μg/L, 批內(nèi)變異系數(shù)≤10%, 批間變異系數(shù)≤10%。樣品測(cè)定均采用雙管平行。通過DFM-96型10管放射免疫γ計(jì)數(shù)器得出讀數(shù), 然后根據(jù)Log-logit法作出標(biāo)準(zhǔn)曲線, 再?gòu)臉?biāo)準(zhǔn)曲線中讀出相應(yīng)的濃度。

1.4 數(shù)據(jù)分析

血清中T和E2含量均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。用SSCP13.0統(tǒng)計(jì)軟件包對(duì)不同組中血清T和E2含量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析, 當(dāng)P＜0.05時(shí)認(rèn)為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 雌核發(fā)育牙鲆性腺的解剖學(xué)和組織學(xué)觀察

圖1 雌核發(fā)育牙鲆中發(fā)育正常和異常的性腺比較Fig. 1 Comparison of normal and abnormal gonad in gynogenetic Paralichthys olivaceus

本研究共選取對(duì)照組2齡牙鲆雌性個(gè)體6尾和2齡雌核發(fā)育牙鲆12尾進(jìn)行觀察和分析。經(jīng)解剖觀察發(fā)現(xiàn), 在對(duì)照組雌性牙鲆個(gè)體中, 性腺飽滿, 為黃白色, 血管豐富。12尾雌核發(fā)育牙鲆的性腺均為卵巢,其中卵巢形態(tài)正常的有 5尾, 與對(duì)照組牙鲆的卵巢相似, 占總體的41.67%; 性腺發(fā)育不完全的有7尾。圖1為雌核發(fā)育牙鲆性腺解剖學(xué)與組織學(xué)觀察結(jié)果。從圖上可以看出, 正常的雌核發(fā)育牙鲆卵巢為一對(duì),呈對(duì)稱分布。每個(gè)卵巢的一端向下延伸, 與泄殖孔相連接, 而另一端較飽滿, 位于腹部靠近腎臟處, 并向后腹部延伸(圖1-1～圖1-3)。圖1-4～圖1-9為發(fā)育不完全或者畸形的卵巢組織, 卵巢兩側(cè)均不對(duì)稱, 其中一側(cè)或多或少地缺失一部分(圖1-4、圖1-5), 有的甚至整個(gè)性腺發(fā)育較差(圖1-7、圖1-8)。切片結(jié)果表明, 其性腺處于卵巢Ⅱ期, 主要以第2時(shí)相卵母細(xì)胞為主, 細(xì)胞多呈梨形或卵圓形, 細(xì)胞質(zhì)強(qiáng)嗜堿性而呈藍(lán)紫色, 細(xì)胞核位于卵細(xì)胞中央, 核內(nèi)染色質(zhì)成絲網(wǎng)狀, 在細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)顆粒狀的油滴。但是, 比較發(fā)現(xiàn)雌核發(fā)育牙鲆中性腺正常和畸形個(gè)體的性腺組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)方面并未有明顯差異(圖1-3、圖1-6、圖1-9)。

2.2 雌核發(fā)育牙鲆個(gè)體血清中T和E2水平的比較

圖2為對(duì)照組雌性和雌核發(fā)育牙鲆血清中T水平的比較。從圖中可以看出, 對(duì)照組牙鲆個(gè)體血清中的睪酮含量(0.109 μg/L±0.028 μg/L)顯著低于雌核發(fā)育個(gè)體(P＜0.05); 而在雌核發(fā)育群體中, 性腺發(fā)育較差的個(gè)體(0.171μg/L±0.095μg/L )比性腺發(fā)育正常的個(gè)體中(0.163μg/L±0.071μg/L )的睪酮含量稍高。

圖2 對(duì)照組和雌核發(fā)育牙鲆血清中T水平的比較Fig. 2 Comparison of T levels among control diploid and gynogenetic P. olivaceus

圖3為對(duì)照組和雌核發(fā)育牙鲆血清中E2水平的比較, 由此看出對(duì)照組的 E2含量(88.372 ng/L±29.457 ng/L)高于雌核發(fā)育牙鲆, 而在雌核發(fā)育牙鲆中, 性腺發(fā)育較差個(gè)體的 E2含量(39.989 ng/L±16.285 ng/L)顯著低于正常雌核發(fā)育(78.40 ng/L±7.140 ng/L)和對(duì)照組牙鲆(P＜ 0.05)。

圖3 對(duì)照組和雌核發(fā)育牙鲆血清中E2水平的比較Fig. 3 Comparison of E2 levels among control diploid and gynogenetic P. olivaceus

3 討論

在人工誘導(dǎo)的許多魚類雌核發(fā)育個(gè)體中, 往往會(huì)發(fā)現(xiàn)一些個(gè)體的性腺不能正常發(fā)育。不正常的現(xiàn)象不僅體現(xiàn)在外觀上, 組織切片發(fā)現(xiàn)其卵巢中甚至含有大量不能完全成熟的卵細(xì)胞, 且常充滿結(jié)締組織。Fujioka[8]和Arai[9]等認(rèn)為這可能是由于在雌核發(fā)育二倍體中某些隱性基因表達(dá)影響了其性腺發(fā)育的一些關(guān)鍵過程。這種現(xiàn)象在牙鲆[10]、鯉魚[11]等種類中均有報(bào)道。但在某些種類中, 如泥鰍(Misgurnus anguillicaudatus)[12]、胡子鯰(Clarias macrocephalus)[13]、歐鱸(Dicentrarchus labrax)[14]雌核發(fā)育雌魚性腺發(fā)育與其二倍體雌魚對(duì)照相似, 沒有發(fā)現(xiàn)異?，F(xiàn)象。通過解剖學(xué)觀察, 發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)培育的雌核發(fā)育牙鲆中, 有較多的個(gè)體性腺發(fā)育不正常。在這些個(gè)體中,性腺或者發(fā)育較小, 或者不能形成兩個(gè)完整的卵巢,甚至有些個(gè)體僅有一邊卵巢。

T和E2水平檢測(cè)比較發(fā)現(xiàn), 雌核發(fā)育個(gè)體中的E2含量也均低于對(duì)照組牙鲆個(gè)體中的含量, 這與歐鱸中的報(bào)道是類似的[15]。進(jìn)一步比較發(fā)現(xiàn), 性腺發(fā)育有缺陷的雌核發(fā)育牙鲆個(gè)體中E2水平顯著低于性腺發(fā)育較好的個(gè)體, 而 T含量卻比發(fā)育較好的個(gè)體中的高。在魚類中, T作為雄激素(如 11-KT)和雌激素(如 E2)合成的前體物質(zhì)間接地發(fā)揮作用[6,16-17], 而E2是卵巢的誘導(dǎo)源[6-7,18]?；谛约に卦谛韵侔l(fā)生、分化與發(fā)育成熟過程中的重要性, 目前多種魚類中已有性激素相關(guān)的報(bào)道。對(duì)雌性斜帶石斑魚(Histriculus similes)[19]研究發(fā)現(xiàn), 在生殖季節(jié)成熟雌魚血清中E2和T含量最高, 平均性腺成熟系數(shù)(GSI)顯著高于其他月份, 并且性激素水平的季節(jié)變化與GSI的變化基本一致。同時(shí), 運(yùn)用性激素處理也可以在一些魚類中實(shí)現(xiàn)性逆轉(zhuǎn)。例如, 利用甲基睪酮處理雌性赤點(diǎn)石斑魚[20], 可以導(dǎo)致其發(fā)生不同程度的性逆轉(zhuǎn), GSI指數(shù)明顯下降, 性腺中卵細(xì)胞退化, 精原細(xì)胞增值, 出現(xiàn)大量精母細(xì)胞和精子細(xì)胞, 性逆轉(zhuǎn)雄魚甚至可以變?yōu)楣δ苄孕埕~, 經(jīng)輕微的腹部擠壓可以排精, 且精子活力與正常雄魚相似。

此外, 雌性和雄性激素的比例常影響著魚體性腺的分化與發(fā)育[19]。在對(duì)褐鱒(Salmo trutta)[18]的研究中發(fā)現(xiàn), 雌性性腺?gòu)?9月份至第二年 2月份期間GSI指數(shù)和性激素水平變化不大, 2月份后GSI指數(shù)迅速上升, 5月份達(dá)到最高值; T和E2含量與GSI指數(shù)變化趨勢(shì)相似, 也是5月份達(dá)到最高值, 之后均又開始下降。卵子成熟過程也與 GSI指數(shù)和性激素含量變化吻合。這與牙鲆性腺成熟規(guī)律很相似。但是,在相同性腺發(fā)育時(shí)期, 鮭魚血清中E2/T含量的比值1.0～1.2左右, 雌核發(fā)育雌魚性腺發(fā)育正常個(gè)體中為0.48, 發(fā)育異常個(gè)體中僅為 0.23, 顯著低于正常二倍體的比值(0.18) (P＜0.05)。我們推測(cè)這種差異引起了雌核發(fā)育群體中不同個(gè)體間性激素比值的差別。而雌性個(gè)體中雌性性激素水平比值的降低可能導(dǎo)致了其性腺發(fā)育不完全, 但這還需要進(jìn)一步研究。

迄今, 有關(guān)雌核發(fā)育魚類性腺發(fā)育情況的報(bào)道并不多, 其內(nèi)分泌學(xué)方面的報(bào)道更少, 本研究從內(nèi)分泌學(xué)水平研究了雌核發(fā)育與對(duì)照組牙鲆血清中 T和E2水平的差異, 為進(jìn)一步開展相關(guān)研究提供了參考。

[1]徐成. 牙鲆雌核發(fā)育分析鑒定與性別決定機(jī)制研究[D]. 北京：中國(guó)科學(xué)院, 2000, 1-34.

[2]胡則輝, 徐君卓. 人工誘導(dǎo)海水魚類雌核發(fā)育的研究進(jìn)展[J]. 海洋漁業(yè), 2007, 29(1)：78-83.

[3]Yamamoto E. Studies on sex-manipulation and production of cloned populations in hirame,Paralichthys olivaceus(TemmincketSchlegel)[J]. Aquaculture,1999, 173：235-246.

[4]楊世勇. 雌核發(fā)育牙鲆的性腺發(fā)育和微衛(wèi)星標(biāo)記分析[D]. 大連：大連水產(chǎn)學(xué)院, 2005, 1-21.

[5]尤鋒, 許建和, 倪靜, 等. 牙鲆同質(zhì)雌核發(fā)育人工誘導(dǎo)研究[J]. 高技術(shù)通訊, 2008, 18(8)：874-880.

[6]Nakamura M, Bhandari R K, Higa M. The role estrogens play in sex differentiation and sex changes of fish[J]. Fish Physiology and Biochemistry, 2003, 28：113-117.

[7]Guzman J M, Norberg B, Ramos J, et al. Vitellogenin,steroid plasma levels and spawning performance of cultured female Senegalese sole (Solea senegalensis)[J].General and Comparative Endocrinology, 2008, 156：285-297.

[8]Fujioka K. Survival, growth and sex ratios of gynogenetic diploid honmoroko[J]. Journal of Fish Biology,1998, 52：430-442.

[9]Arai K. Genetic improvement of aquaculture finfish species by chromosome manipulation techniques in Japan[J]. Aquaculture, 2001, 197：205-228.

[10]Tabata K, Gorie S, Nakamura K. Induction of gynogenetic diploid in hirameParalichthys olivaceus[J]. Nippon Suisan Gakkaishi, 1986, 52(11)：1 901-1 904.

[11]Komen J, Bongers A B J, Richter C J J, et al. Gynogenesis in common carp (Cyprinus carpio)：Ⅱ. The production of homozygous gynogenetic clones and F1 hybrids[J]. Aquaculture, 1991, 92：127-142.

[12]Suzuki R, Oshiro T, Nakanishi T. Survival, growth and fertility of gynogenetic diploids induced in the cyprinid loach,Misgurnus anguillicaudatus[J]. Aquaculture,1985, 48：45-55.

[13]Na-Nakorn U. Comparison of cold and heat shocks to induce diploid gynogenesis in thai walking catfish(Clarias macrocephalus) and performances of gynogens[J]. Aquat Living Resour, 1995, 8：333-341.

[14]Felip A, Piferrer F, Zanuy S, et al. Comparative growth performance of diploid and triploid European sea bass over the first four spawning seasons[J]. Journal of Fish Biology, 2001, 58：76-88.

[15]Rougeot C, Krim A, Mandiki S N M, et al. Sex steroid dynamics during embryogenesis and sexual differentiation in Eurasian perch,Perca fluviatilis[J]. Theriogenology, 2007, 67：1 046-1 052.

[16]Rothbard S, Yaron Z. Changes in steroids concentrations during sexual ontogenesis in tilapia[J]. Aquaculture, 1987, 61：59-74.

[17]Fitzpatrick M S, Pereira C B, Schreck C B. In vitro steroid secretion during early development of mono-sex rainbow trout：sex differences, onset of pituitary control,and effects of dietary steroid treatment[J]. General and Comparative Endocrinology, 1993, 91：199-215.

[18]Estay F, Diaz A, Pedrazza R, et al. Oogenesis and plasma levels of sex steroids in cultured females of Brown Trout (Salmo truttaLinnaeus, 1758) in Chile[J]. Journal of Experimental Zoology, 2003,298A：60-66.

[19]趙會(huì)宏, 劉曉春, 劉付永忠, 等. 斜帶石斑魚雌魚卵巢發(fā)育與血清性類固醇激素的生殖周期變化[J]. 中山大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2003, 42(6)：56-59.

[20]李廣麗, 劉曉春, 林浩然. 17-甲基睪酮對(duì)赤點(diǎn)石斑魚性逆轉(zhuǎn)的影響[J]. 水產(chǎn)學(xué)報(bào), 2006, 30(2)：145-150.

Comparison of the levels of T and E2 in normal and gynogeneticParalichthys olivaceus

SUN Peng1,2, YOU Feng1, LI Jun1, SONG Zong-cheng3, ZHANG Pei-jun1
(1. Key Laboratory of Experimental Marine Biology, Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences,Qingdao 266071, China; 2. Key and Open Laboratory of Marine and Estuarine Fisheries Resources and Ecology,East China Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Shanghai 200090, China;3. Shenghang Science and Technology Co., Ltd, Weihai 264200, China)

Nov., 3, 2010

Paralichthys olivaceus; gynogenesis; ovary; T; E2

Levels of serum T and E2 were analyzed by radioimmunoassay (RIA) in gynogenetic and control diploid individuals ofParalichthys olivaceus. Gynogenetic individuals had higher T levels and lower E2 levels than those control diploid individuals. In addition, higher T level and lower E2 level are observed in individuals with abnormal ovary when compared with gynogenetic and control diploid flounders. We suggested that there might be difference in serum T and E2 levels between gynogenetic and control diploidP. olivaceus, and also between gynogenetic individuals with normal and abnormal ovary development. These differences probably resulted in the abnormal ovary development of some gynogenetic individuals. The results will provide information to study ovary development and endocrinology of normal and gynogenetic flounders.

Q418 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1000-3096(2011)12-0010-05

2010-11-03;

2010-12-08

中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)項(xiàng)目(東2009M05);公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)項(xiàng)目(200903046); 國(guó)家“863”計(jì)劃資助項(xiàng)目(2006AA10A404); 鲆鰈類產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(nycytx-50); 山東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(ZR2010CM007)

孫鵬(1980-), 博士, 助理研究員, 主要從事海水魚類遺傳與發(fā)育學(xué)研究, E-mail：sunpeng1128@163.com; 尤鋒, 通信作者, E-mail：youfeng@qdio.ac.cn

譚雪靜)