施碧紅，李強，陳明，吳偉斌，施巧琴，吳松剛

1(福建師范大學教育部工業(yè)微生物工程研究中心，福建福州，350108)2(福建師范大學生命科學學院，福建福州，350108)

微生物脂肪酶是工業(yè)用脂肪酶的一個重要來源。工業(yè)催化上要求脂肪酶具有高的活性、穩(wěn)定性以及對底物的特異性。擴展青霉(Penicillium expansum)FS1884所產(chǎn)堿性脂肪酶是國產(chǎn)商品化的堿性脂肪酶制劑，已被用于洗滌、面包加工、皮革脫脂、魚類脫脂等領域。但實際應用中仍需進一步提高該脂肪酶的熱穩(wěn)定性和酶活力。擴展青霉FS1884是經(jīng)過20多代物理化學誘變后的高產(chǎn)突變株，對各種物理化學誘變劑已產(chǎn)生一定的飽和效應，用傳統(tǒng)的誘變技術進一步改善其所產(chǎn)脂肪酶的性質或提高酶活已出現(xiàn)困難。且傳統(tǒng)的誘變育種方法具有篩選工作量大、突變體遺傳背景不清楚等缺點。易錯PCR(error-prone PCR)技術直接對目標蛋白質的編碼序列進行隨機突變，進而定向篩選理想性狀的蛋白質，為改良目標蛋白及解析蛋白質的結構與功能關系提供快捷途徑。大腸桿菌中，高絲氨酸－琥珀酰轉移酶(MetA)是甲硫氨酸合成途徑中第1個關鍵酶，該酶使其無法適應高溫的生長環(huán)境，Mordukhova［1］通過易錯 PCR 技術，篩選到了1株MetA的突變株，其中有5個氨基酸發(fā)生了突變:S61T，E213V，I229T，N267D和 N271K，使其能在更高的溫度下(44℃)生長。Niu［2］等通過定向進化(易錯PCR和DNA Shuffling結合)的研究方法，建立Rhizopus arrhizus脂肪酶隨機突變文庫，篩選到1株最適作用溫度提高10℃的突變株，且突變株在50℃下的半衰期比野生型脂肪酶提高了12倍。Kim［3］通過易錯PCR和重疊延伸PCR結合的方法，篩選到了1株突變體，在50℃和55℃放置2h后殘余活力分別為30%和10%，而野生型在此條件下均失去活性，突變體的耐熱性大大提高。

本研究利用易錯PCR技術對擴展青霉脂肪酶基因進行隨機突變，建立隨機突變文庫，通過高通量篩選，期望獲得脂肪酶耐熱性和酶活力都有所提高的突變株。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質粒

Pichia pastorisGS115、pPIC3.5K，由福建師范大學林琳教授提供，E.coliJM109由本實驗室保存。pPIC3.5k-PEL為本實驗室構建并保存［4］，PEL為Penicillium expansumlipase的縮寫(下同)。

1.1.2 培養(yǎng)基

LB、YPD、MD、BMGY、BMMY、MM 均根據(jù) invitrogen公司Multi-Copy Pichia Expression Kit說明配制，OMM平板為MM平板加上2.5%橄欖油乳化液，橄欖油檢驗板為含有2.5%橄欖油乳化液的瓊脂板。

1.1.3 引物

引物P1，P2用于從pPIC3.5K-PEL質粒上擴增脂肪酶(PEL)基因，其設計原理見參考文獻［4］:

P3:5＇GACTGGTTCCAATTGACAAGC 3＇(5’AOX引物)

P4:5＇GGCAAATGGCATTCTGACATCCT 3＇(3’AOX引物)

1.2 方法

1.2.1 脂肪酶隨機突變庫的建立

以含擴展青霉脂肪酶基因的pPIC3.5k-PEL質粒DNA為摸板，P1，P2為引物進行易錯 PCR。100μL PCR 體系如下:10 ×PCR Buffer 10 μL，dATP(100 mmol/L)0.2μL，dGTP(100 mmol/L)0.2μL，dCTP(100 mmol/L)1μL，dTTP(100 mmol/L)1μL，MgCl2(25 mmol/L)20 μL ，MnCl2(10 mmol/L)1 μL ，P1Primer(10 μmol/L)1 μL，P2Primer(10μmol/L)1μL，大量抽提 pPIC3.5k-PEL 質粒 DNA 1μL ，TaqDNA Polymerase 2 U，再加入滅菌超純水到100 μL。擴增程序為:94℃ 2 min;30×(94℃ 1 min，55℃ 1 min，72℃ 1 min);72℃ 7 min。

PCR擴增的突變產(chǎn)物用BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切，與經(jīng)相同雙酶切的pPIC3.5k連接，構建表達載體pPIC3.5k-PEL-Mut，，轉化大腸桿菌 JM109，構建突變體庫。

1.2.2 突變文庫的篩選

大量抽提突變體庫質粒，經(jīng)SalⅠ線性化后電轉畢赤酵母GS115，涂布于MD平板上，用無菌牙簽挑選轉化子到含有1%橄欖油乳化液的OMM平板上進行初篩。OMM平板含有0.5%的甲醇，可誘導pPIC3.5K上的AOX啟動子，啟動脂肪酶的表達，水解橄欖油乳化液后形成水解圈。以含有野生型脂肪酶基因的畢赤酵母GS115(PEL-GS)為對照進行初篩，選擇在OMM平板上產(chǎn)生比野生型脂肪酶透明圈大的菌落，進行復篩。

將初篩獲得的各菌株分別接種1 mL BMMY液體培養(yǎng)基進行搖管發(fā)酵，30℃振蕩培養(yǎng)72 h，培養(yǎng)液經(jīng)過離心后，平板檢測酶的活性，耐熱性，耐酸性等，篩選優(yōu)良突變株，搖管復篩中以PEL-GS115為對照。

將搖管復篩獲得的優(yōu)良突變菌株在含甲醇的BMMY培養(yǎng)基中進行搖瓶發(fā)酵，誘導畢赤酵母表達脂肪酶，測定脂肪酶活性和耐熱性以及最適作用溫度等。

1.2.3 表達產(chǎn)物鑒定

平板透明圈法檢測脂肪酶活性，在pH9.4的緩沖液中加入2%瓊脂粉，并加入2.5%的橄欖油乳化液，制成檢驗板，用打孔器打孔，每孔加入發(fā)酵液10 μL，37℃放置24 h，觀察產(chǎn)生的水解圈的大小。

1.2.4 脂肪酶活性的測定

以橄欖油為底物，采用NaOH滴定法［5］測定酶活力。

1.2.5 突變脂肪酶最適作用溫度

以橄欖油為底物，在 30、35、40、45、50℃下，采用NaOH滴定法分別測定PEL-GS(野生重組酶)和突變體脂肪酶(ep3-GS)的酶活，以相對酶活確定突變酶的最適作用溫度，與對照相比，觀察酶活性的提高程度。

1.2.6 突變脂肪酶熱穩(wěn)定性

分別將野生重組酶PEL-GS和突變體脂肪酶在30，35，40，45，50℃ 溫育 30 min 后，迅速置冰浴 30 min，在pH9.4，35℃測定酶的殘余活力。以未經(jīng)溫度處理的酶液的酶活力為100%，換算不同溫度處理后的殘余酶活百分比，制作對溫度的變化曲線，確定酶的熱穩(wěn)定性。

1.2.7 突變酶的適宜反應pH值

在不同pH的橄欖油平板上，采用透明圈法分別測定突變脂肪酶與野生脂肪酶的酶活力。其中pH 6.0、pH 7.0、pH 8.0橄欖油乳化平板由 K2HPO4-KH2PO4緩沖體系配制，pH 9.4及 pH 10.0橄欖油平板由甘氨酸-NaOH緩沖體系配制。分別以突變酶及野生酶的最大脂肪酶活力為100%，換算相對酶活力，以相對酶活對反應pH值作圖，確定突變脂肪酶及野生重組酶的適宜pH值。

1.2.8 正向突變株堿性脂肪酶基因的序列測定、結構預測和突變位點分析

提取高酶活的畢赤酵母突變菌株的基因組DNA［6－7］，PCR 擴增及酶切驗證突變脂肪酶基因 cDNA，由invitrogen公司進行脂肪酶基因的序列測定。在SWISSMODEL數(shù)據(jù)庫輸入突變蛋白的氨基酸序列，預測蛋白的三級結構，分析位點突變效應。

2 結果與分析

2.1 突變脂肪酶基因的獲得及突變文庫的構建

使用P1、P2為引物在優(yōu)化后的易錯PCR條件下擴增擴展青霉脂肪酶cDNA片段，易錯PCR產(chǎn)物如圖1，條帶大小為900bp左右，符合預期大小。經(jīng)純化并雙酶切的易錯PCR產(chǎn)物，與pPIC3.5k載體連接，轉化大腸桿菌JM109，得到了約104個轉化子的突變文庫。

2.2 突變文庫的篩選

將文庫的轉化子經(jīng) LB液體培養(yǎng)，抽提質粒DNA，轉化畢赤酵母GS115，涂布在MD平板，經(jīng)過初篩，篩選了大約4 000株轉化了含有目的突變基因的畢赤酵母(圖2)，其中選擇了約300株進行小量的發(fā)酵實驗，經(jīng)過72 h的誘導，脂肪酶在畢赤酵母中得到成功表達。分別取10 μL發(fā)酵上清液在3種不同條件的檢驗板進行酶活測定篩選，篩選1株優(yōu)良突變株ep3。該突變株在橄欖油平板上透明圈達到2.2 cm。

圖1 易錯PCR產(chǎn)物效果圖

圖2 突變株在含橄欖油平板上的篩選

2.3 突變脂肪酶的性質

對突變株ep3產(chǎn)生的脂肪酶ep3-GS和野生型重組酶的表達產(chǎn)物(PEL-GS)進行不同溫度下酶活測定，發(fā)現(xiàn)突變酶的最適作用溫度與野生重組酶一致，均為35℃ (圖3)，35℃時突變酶ep3-GS的活力為3 440 U/mg，比該溫度下野生型重組脂肪酶PEL-GS的酶活提高了17%;突變酶及野生重組酶的表達量分別為0.7、0.6 mg/mL。溫度對突變脂肪酶的影響顯著，50℃時突變酶的活性僅為最適反應溫度(35℃)下酶活的30%。

圖3 ep3-GS與PEL-GS的最適作用溫度

將野生型PEL-GS與突變體脂肪酶ep3-GS分別在不同溫度放置30 min，測其殘余酶活，結果顯示，突變體脂肪酶的熱穩(wěn)定性相比于野生型的脂肪酶有了一定的改善，突變體脂肪酶45℃放置0.5h殘余34%的活力，40℃放置0.5 h殘余52%的活力，均高于野生型酶的耐熱性(圖4)。

圖4 突變體脂肪酶與野生型脂肪酶的耐熱性

對突變脂肪酶ep3-GS和野生型重組酶PEL-GS在不同pH值的橄欖油平板上進行酶活測定，發(fā)現(xiàn)突變酶的最適pH值沒有發(fā)生明顯變化，與野生重組酶一致，為pH9.4(圖5)。

圖5 突變體脂肪酶與野生型脂肪酶的最適pH

2.4 突變脂肪酶基因的結構預測與突變位點的檢測

利用SWISSMODEL REPOSITORY對突變脂肪酶進行結構預測，發(fā)現(xiàn)突變脂肪酶ep3-GS的三級結構與野生型脂肪酶PEL-GS無明顯差異。測序結果顯示，脂肪酶基因的424位堿基發(fā)生突變，即A424G。突變脂肪酶一級結構發(fā)生一個氨基酸的變化，142位上的氨基酸由堿性氨基酸賴氨酸突變成酸性氨基酸谷氨酸(LYS142GLU)。

3 討論

本研究利用易錯PCR的隨機突變能力，簡單快速地在擴展青霉堿性脂肪酶基因上制造核苷酸變化，通過調(diào)節(jié)易錯PCR體系中Mn2+的濃度，調(diào)控堿基突變率，使氨基酸突變率穩(wěn)定在每個基因1～2個的范圍內(nèi)［8］，獲得了脂肪酶突變基因群，構建擴展青霉堿性脂肪酶基因突變文庫。同時利用脂肪酶對橄欖油的水解能力，建立了簡單、快捷、經(jīng)濟的高通量平板篩選方法。在含橄欖油底物的各種平板上，直接觀察菌落周圍或酶液周圍的水解圈大小，直觀、高效地挑選不同條件下水解能力強的突變株。多個突變體篩選同時進行，提高了篩選效率。

擴展青霉堿性脂肪酶屬于α/β型水解酶，含285個氨基酸，其中前27個氨基酸為信號肽和前肽，其余258個氨基酸組成成熟肽［9］。擴展青霉脂肪酶的活性中心是由高度保守的Ser-Asp-His組成的催化三聯(lián)體，包埋在脂肪酶空間結構中央的β-折疊的環(huán)中，形成疏水環(huán)境?；钚灾行耐庥幸欢桅谅菪纬傻纳w子，在非激活狀態(tài)下掩蓋催化中心，起保護作用。脂肪酶被激活時，這個蓋子就打開，暴露活性中心［9－11］。測序結果顯示，142位的賴氨酸突變?yōu)楣劝彼?Lys142Glu)，由堿性氨基酸變?yōu)樗嵝园被?，在空間結構上，該氨基酸位于脂肪酶結構的第4個α螺旋上，該α螺旋緊靠第2個β折疊，142位的賴氨酸突變?yōu)樗嵝缘墓劝彼?，谷氨酸可與空間位置上靠近的堿性氨基酸形成鹽橋，如與第2個β折疊上63位的賴氨酸形成鹽橋，鹽橋的形成可能對α螺旋的構象翻轉起到支持作用，因而促進脂肪酶水解能力提高。

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