司曉喜, 袁智泉, 邱賀媛,2, 肖小華＊, 李攻科＊

(1.中山大學(xué)化學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院,廣東廣州510275;2.韓山師范學(xué)院化學(xué)系,廣東潮州 521041)

海藻有效成分的提取分離研究進(jìn)展

司曉喜1, 袁智泉1, 邱賀媛1,2, 肖小華1＊, 李攻科1＊

(1.中山大學(xué)化學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院,廣東廣州510275;2.韓山師范學(xué)院化學(xué)系,廣東潮州 521041)

海藻種類多樣,資源豐富,提取分離和純化制備其中結(jié)構(gòu)特殊的有效成分,在藻類天然產(chǎn)品和新藥開發(fā)等方面有重要意義.本文綜述了海藻有效成分的提取分離研究進(jìn)展,重點(diǎn)介紹了海藻中多糖、脂質(zhì)、色素、多酚和萜類的提取分離技術(shù),包括溶劑提取、超臨界流體提取、加壓溶劑提取、超聲波輔助提取和微波輔助提取等,以及這些有效成分常用的制備液相色譜、高速逆流色譜等純化制備技術(shù)的應(yīng)用進(jìn)展.

海藻;有效成分;提取分離;純化制備

0 引言

海藻(algae或 seaweeds)種類多樣、資源豐富,其特殊的生物形態(tài)和生長環(huán)境可能產(chǎn)生結(jié)構(gòu)特殊的生物活性物質(zhì)和代謝產(chǎn)物,是海洋有效成分的主要來源.海藻有效成分具有結(jié)構(gòu)新穎性、多樣性和復(fù)雜性的特點(diǎn),主要分為兩類:一類是難以被消化吸收的黏性多糖;另一類是分子量較小、吸收后能直接或間接影響體內(nèi)代謝的物質(zhì),包括脂類、酚類、萜類、生物堿和類胡蘿卜素等[1].它們具有抗氧化、抗病毒、抗腫瘤、抗凝血、抗增殖及調(diào)節(jié)免疫機(jī)能等多種生理活性和藥用功能[1-2].深入研究海藻有效成分快速高效的提取分離技術(shù)對(duì)開發(fā)海藻類天然產(chǎn)品、保健品,發(fā)掘新的藥用成分和先

導(dǎo)化合物具有重要意義.本文綜述了近幾年來海藻中有效成分的提取分離研究進(jìn)展,重點(diǎn)介紹了海藻中多糖、脂質(zhì)、色素等有效成分的提取和分離技術(shù).

1 海藻有效成分的提取技術(shù)

海藻有效成分提取通常在室溫和避光條件下進(jìn)行,樣品經(jīng)脫脂、除鹽和去色素后,一般采用溶劑提取法如浸漬數(shù)小時(shí)至幾天.超臨界流體提取(SFE)、加壓溶劑提取(PLE)、超聲波輔助提取(UAE)和微波輔助提取(MAE)等現(xiàn)代提取技術(shù)在提取效率、提取時(shí)間、溶劑消耗量和能耗方面有突出的優(yōu)勢(shì),其中:SFE法條件溫和,適合高活性有效成分的提取,主要用于海藻中不飽和脂肪酸、類胡蘿卜素、維生素等親油性成分的提取;PLE法在高溫高壓、惰性和避光條件下提取,主要用于海藻中脂肪酸、色素和多酚的提取;UAE法通過超聲波的空化作用使藻體細(xì)胞破碎,多用于海藻中多糖和色素的提取;MA E法通過微波的內(nèi)加熱作用實(shí)現(xiàn)快速高效的提取,用于海藻多糖、色素、多酚的提取;酶解提取法采用酶將細(xì)胞壁破壞,有利于保持物質(zhì)活性,用于海藻多糖、多酚的提取.由于海藻中有效成分性質(zhì)各異,因此需要針對(duì)目標(biāo)物的性質(zhì),結(jié)合各種技術(shù)的原理、特點(diǎn)和適用范圍選取相應(yīng)的提取方法.

1.1 海藻多糖的提取方法

海藻多糖占海藻干重的50%以上,其種類豐富,具有獨(dú)特的化學(xué)組成、結(jié)構(gòu)和生物活性,逐步成為生物多糖的主要來源之一.

海藻多糖是一類多組分混合物,不同提取方法從不同海藻中得到的多糖組成和活性差異較大.表1列舉了海藻多糖的常用提取方法.其中水提、酸提、堿提及沉淀法是海藻多糖提取普遍采用的方法.水提法的中性提取環(huán)境可避免多糖的水解并保持其活性;酸提法用于提取溶于稀酸水溶液的多糖,較低的p H值可避免褐藻酸溶出;堿提法常用于提取堿溶性多糖和海藻酸鈉;沉淀法常用乙醇和氯化鈣為沉淀劑,通常用氯化鈣沉淀除去褐藻酸,再以乙醇沉淀得多糖.此外,提取溫度、時(shí)間、溶劑量及p H值等對(duì)多糖的提取率和純度會(huì)產(chǎn)生影響.單一提取法得到的多糖種類單一,而采用多級(jí)提取法并結(jié)合不同方法可依次得到不同性質(zhì)的多糖,提高原料的利用率.采用 UA E[5]、MAE[6]以及酶解提取法[4]等能有效提高海藻多糖的提取效率.酶解技術(shù)條件溫和,可有效保持海藻多糖的純天然性[4].UAE法和MAE法高效快速,但過長的超聲波或微波作用可能使大分子的多糖斷裂.此外,UA E法和MAE法提取得到的多糖的組成和活性尚未得到深入研究.如何選擇性、快速的提取得到高活性、多組分的海藻多糖,仍需要結(jié)合不同提取技術(shù)的優(yōu)勢(shì)以及多糖活性篩選、結(jié)構(gòu)鑒定等手段進(jìn)一步研究.

表1 海藻多糖的常用提取方法

1.2 脂質(zhì)的提取方法

海藻中總脂含量高,脂肪酸組成簡單,富含多不飽和脂肪酸(PU FA),如γ-亞麻酸、二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)等.表2列舉了海藻中脂質(zhì)的常用提取方法.脂質(zhì)需在低溫下提取以防止 PUFA氧化,常采用溶劑提取法,常用溶劑有乙醇、乙醚、石油醚以及氯仿-甲醇等混合溶劑[7].由于不同海藻中PUFA分布于極性脂和中性脂中的含量不同,需要有針對(duì)性地選取提取溶劑.此外,通過反復(fù)凍融等方法可加速藻體破壁以提高提取效率[8].采用 UAE[8]、SFE[9]和PLE[10]等方法也可提高海藻中脂質(zhì)的提取效率,特別適合海藻中PUFA的提取.目前海藻的脂質(zhì)提取物主要用于成分分析或活性測(cè)試,較少用于脂肪酸的進(jìn)一步分離制備.陳煒等[11]將UAE法提取得到的粗脂進(jìn)行水解和酯化,通過尿素包合法分離和富集得到高PUFA含量的脂肪酸.

表2 海藻中脂質(zhì)的常用提取方法

1.3 色素的提取方法

海藻色素包括葉綠素、類胡蘿卜素和藻膽蛋白3類,海藻中色素的常用提取方法見表3.

海藻中葉綠素含量高,廣泛用作天然食用色素,主要采用溶劑提取,提取過程低溫避光并避免長時(shí)間加熱[20].通常以醇類和丙酮為提取溶劑,其中醇類提取效果好,但丙酮提取液穩(wěn)定.采用SFE和UAE等技術(shù)提取葉綠素具有很高的效率,并可避免溫度和光等因素所致葉綠素a的降解,其中SFE法已用于工業(yè)化生產(chǎn)葉綠素,產(chǎn)率高、產(chǎn)品性質(zhì)穩(wěn)定、安全可靠,適合作為食品添加劑生產(chǎn)方法使用[20].

海藻中類胡蘿卜素包括胡蘿卜素、葉黃素和類胡蘿卜酸3類,其功能多樣,性質(zhì)獨(dú)特,分布廣泛,具有很好的開發(fā)前景.類胡蘿卜素通常采用丙酮、乙醚、石油醚等有機(jī)溶劑提取,由于類胡蘿卜素酯的存在,采用皂化提取法可得到游離的類胡蘿卜素[14],但提取步驟多、時(shí)間長.采用UAE[15]、SFE[13]、MAE[16]法能顯著加速海藻中類胡蘿卜素的提取過程,其中SFE法選擇性最高,通過控制壓力等條件,可提取得到低葉綠素含量的類胡蘿卜素提取物[15].

藻膽蛋白是紅藻和藍(lán)藻特有的捕光色素蛋白,屬胞內(nèi)蛋白質(zhì),細(xì)胞的破碎是提取藻膽蛋白的關(guān)鍵.通常以水為溶劑,通過反復(fù)凍融、溶脹、組織搗碎、珠磨、高壓均質(zhì)和超聲波震蕩等方法實(shí)現(xiàn)藻體破碎和藻膽蛋白溶出,其中反復(fù)凍融法適于規(guī)模化細(xì)胞破碎.另外,加入酶(如纖維素酶)或化學(xué)試劑(如十二烷基苯磺酸鈉)也可破壞細(xì)胞壁和細(xì)胞膜,使藻膽蛋白滲出[21].采用單一的方法提取效果不佳,通常結(jié)合多種方法通過最大限度地破碎藻體來提取.借助UA E[18]和 PLE法[19]等提取技術(shù)可大大提高藻膽蛋白的提取效率.

表3 海藻中色素的常用提取方法

1.4 酚類的提取方法

酚類是海藻抵抗生物吞食及抗感染的重要物質(zhì),包括簡單酚類和多酚類.通常采用水提法和有機(jī)溶劑提取法,此外 UAE、MAE、SFE和酶提取法等也有應(yīng)用.多酚對(duì)溫度敏感,一般在暗室浸提,如Shibata等[22]采用甲醇提取穴狀昆布和嘉祐中的多酚時(shí),樣品于室溫浸提3 h后分散勻漿,經(jīng)多步溶劑提取得到多酚粗提物.用有機(jī)溶劑提取的多酚,其純度、提取率比水提法高,但產(chǎn)品的抗氧化程度和安全性較低.酶解法條件溫和,提取率高,能較好地保持提取物的抗氧化性[23].SFE法[24]的溶劑極易滲透到海藻的基質(zhì)中,可從鈍頂螺旋藻中提取到低含量的酚類物質(zhì),提取率高,無溶劑殘留,且操作溫度低而不破壞有效成分.采用MAE法以體積比為15%乙醇水溶液提取鼠尾藻總多酚,微波作用40 s的提取效果優(yōu)于UA E法,且快速高效[25].

1.5 萜類的提取方法

萜類是海藻保護(hù)自己所產(chǎn)生的最具代表性的次生代謝物,多數(shù)為鹵代或芳香族萜類化合物,生物活性強(qiáng),一般采用有機(jī)溶劑提取.藻體以甲醇和乙醇反復(fù)浸提,提取物再以乙酸乙酯等提取萜類化合物,如 Fisch等[26]以甲醇從囊葉藻中提取具有抗氧化性的混源萜類化合物,提取液經(jīng)二氯甲烷反復(fù)提取可得到萜類粗提物.李娜等[27]采用SFE法于30 MPa、40℃下提取蜈蚣藻中萜類化合物僅需2 h,且提取溫度低、時(shí)間短、得油率高.

為了提高海藻的利用率,采用多級(jí)提取法將各成分所需的提取法按一定的順序有機(jī)結(jié)合起來,可從海藻中逐一獲得各有效成分.此外,SFE、UAE、PLE和MAE等提取技術(shù)所表現(xiàn)出的快速高效、自動(dòng)化和產(chǎn)品質(zhì)量高等優(yōu)點(diǎn),在海藻有效成分提取中有巨大的發(fā)展前景.

2 海藻有效成分的純化制備技術(shù)

通過各種提取技術(shù)從海藻中獲得的提取液,一般混有較多雜質(zhì),為了進(jìn)一步闡明其中有效成分的結(jié)構(gòu)及生物活性等,需要借助快速有效的純化技術(shù)制備有效成分對(duì)照品.其中液-固色譜技術(shù)最為常用,制備量可達(dá)毫克至克級(jí),供選擇的固定相多樣,可滿足海藻中不同性質(zhì)有效成分的分離,如硅膠可用于脂肪酸、類胡蘿卜素、萜類、甾醇等極性化合物和不飽和化合物的分離,離子交換樹脂和凝膠用于海藻多糖的分離.通常以傳統(tǒng)色譜法如柱色譜(CC)和制備薄層色譜(PTLC)等對(duì)海藻粗提物進(jìn)行初步分離,并結(jié)合制備液相色譜純化得到化合物純品.目前,HSCCC在海藻中的應(yīng)用限于脂肪酸和類胡蘿卜素的分離,用于毫克級(jí)純品的制備,但其可直接分離粗提物,且條件溫和,可供選擇的溶劑體系多樣,彌補(bǔ)了制備液相色譜樣品前處理要求高的不足.

2.1 傳統(tǒng)液-固色譜技術(shù)

以柱色譜和薄層色譜為主的傳統(tǒng)液-固色譜分離能力有限,但其設(shè)備要求低,簡單方便,制備量大,主要用于海藻粗提物的初步分離.

柱色譜制備量可達(dá)毫克至克級(jí),主要用于純化的第一步.硅膠柱、離子交換柱、凝膠柱等常用于海藻中有效成分的制備,其中硅膠柱使用最為廣泛,如 Kanazawa等[28]采用活性炭分散硅膠為填料的工業(yè)規(guī)模柱色譜,從10 t昆布中分離得到1 490 g巖藻黃素,回收率達(dá)82%,但產(chǎn)品純度較低.凝膠柱的分辨率較硅膠柱低[29],但簡單快速,適用于海藻多糖、抗凝血?jiǎng)┑姆蛛x.離子交換色譜常用于海藻中多糖和藻蛋白的分離[30],也用于除鹽[31].制備薄層色譜常用于分離幾十毫克至幾百毫克的樣品,一般作為純化的第二步,經(jīng)常配合柱色譜使用.Kittaka-Katsura等[32]采用硅膠PTLC進(jìn)一步分離由柱色譜從小球藻中分離得到的活性組分,得到富含維生素B12的組分.

2.2 制備液相色譜技術(shù)

制備液相色譜可實(shí)現(xiàn)克級(jí)以上樣品的分離.根據(jù)壓力可分為快速色譜(約0.2 MPa)、低壓液相色譜(＜0.5 MPa)、中壓液相色譜(0.5～2.0 MPa)和高壓液相色譜(＞2.0 MPa).最常采用的是制備型和半制備型 HPLC,其柱長短、內(nèi)徑大、填料顆粒小,在高壓高流速下其分離效率極高,而且自動(dòng)化和多功能化,通常作為海藻有效成分分離的最后一步(精制有效成分).表4中列舉了制備液相色譜在海藻有效成分分離純化中的應(yīng)用.

表4 制備液相色譜在海藻有效成分分離純化中的應(yīng)用

根據(jù)海藻中有效成分的性質(zhì)選擇色譜柱尺寸、固定相種類(硅膠、C18、凝膠等)和粒度、分離模式(反相、正相、離子交換、體積排阻等)、壓力、流動(dòng)相等.快速色譜用于復(fù)雜混合物的預(yù)先分離,低壓液相色譜可作為中間或最后的分離步驟,中壓液相色譜比低壓液相色譜有更高的分辨率和更短的分離時(shí)間,可用于最后的純化步驟,如用于分離裙帶菜和孔石莼的脂肪酸粗提物,上樣量達(dá)600mg,可獲得多種高純度的 PUFA[33].HPLC的柱效更高,但其色譜柱易污染,樣品需預(yù)處理除雜,通常用于粗品的精制.分析型 HPLC也可精制得到毫克級(jí)純品,如 Cho等[34]采用分析型HPLC純化由柱色譜從鐵釘菜中分離得到的粗提物,獲得毫克級(jí)高純度的甲氧基脂肪酸.此外,高效離子交換色譜、高效凝膠色譜等常用于海藻多糖等有效成分的純化制備.于廣利等[35]采用高效強(qiáng)陰離子交換色譜從刺松藻粗多糖中分離得到11種結(jié)構(gòu)不同的多糖組分.制備液相色譜作為海藻有效成分純化制備中的關(guān)鍵技術(shù),結(jié)合預(yù)分離技術(shù)對(duì)粗提物預(yù)先純化,可提高其制備量和純化效果.

2.3 高速逆流色譜技術(shù)

高速逆流色譜(HSCCC)是一種連續(xù)高效的液-液分配色譜分離技術(shù),無需固相載體,可直接分離粗提物,避免了因不可逆吸附以及樣品前處理步驟引起的樣品損失、失活、變性等,能完整保留目標(biāo)物活性,回收率高,已用于從海藻粗提物中分離制備脂肪酸、類胡蘿卜素,以及粗提物的預(yù)分離.Chen等[38]以正己烷-乙酸乙酯-乙醇-水(體積比為8∶2∶7∶3)為溶劑體系,采用 HSCCC從150 mg微囊藻的皂化提取物中分離得到純度大于96.2%的玉米黃質(zhì),回收率達(dá) 91.4%.與HPLC相比,HSCCC的分離過程和機(jī)理大為簡化,極大地克服了 HPLC色譜柱易污染、分離重現(xiàn)性差、目標(biāo)物在分離過程中易變化的問題.Bousquet等[39]采用 HSCCC通過兩步分離獲得高純度的亞麻酸、十八碳四烯酸、EPA和DHA,上樣量達(dá)130 g,且不飽和脂肪酸活性不變.

2.4 其他分離純化技術(shù)

膜分離技術(shù)、分子蒸餾技術(shù)等也常用于海藻有效成分的分離制備.膜分離是以選擇性透過膜為分離介質(zhì),包括微濾、超濾、納濾和反滲透等,特別適用于海藻中多糖等的分離純化.Ye等[40]采用超濾技術(shù),以1.0×10-4mm孔徑的膜過濾馬尾藻的多糖提取液,得到3個(gè)粗多糖組分.采用超濾技術(shù)還可提高海藻酸鈉成品的純度、黏度、色澤等[41],該方法在海藻酸鈉大規(guī)模工業(yè)分離、提純等方面極具發(fā)展前景.

分子蒸餾技術(shù)用于液-液分離或精制,在高真空、遠(yuǎn)離沸點(diǎn)下操作,具有溫度低、受熱時(shí)間短、分離效率高等特點(diǎn),適合于熱敏性、高沸點(diǎn)物質(zhì)的分離.石勇等[42]將分子蒸餾法與 SFE法結(jié)合,從螺旋藻中分離得到多種脂類和生物堿.

海藻樣品基體復(fù)雜、化合物結(jié)構(gòu)多樣,采用單一技術(shù)難于分離得到高純度產(chǎn)品.通常先用分離效率較低但簡單、上樣量大的PTLC、柱色譜和快速色譜預(yù)處理海藻提取物,得到不同性質(zhì)的混合組分,然后采用柱效高的制備液相色譜進(jìn)一步分離制備,即集成多種分離技術(shù)提高分離制備效率.王威等[36]采用溶劑萃取和大孔吸附樹脂柱色譜預(yù)分離羊棲菜的提取物,得到的各組分再結(jié)合硅膠柱色譜和制備型 HPLC分離,可得到高純度的6種甾醇和2種糖脂,制備得到的有效成分種類多,大大提高了分離純化效率和原料的利用率.

3 結(jié)論

隨著人們對(duì)海藻及其有效成分認(rèn)識(shí)的逐步深入,海藻有效成分的價(jià)值正逐步得到認(rèn)同,大規(guī)模開發(fā)利用海藻類天然產(chǎn)物已成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn),但海藻有效成分對(duì)照品缺乏、開發(fā)成本高昂成為其開發(fā)利用的瓶頸.如何在分離純化技術(shù)上取得突破,低成本、高效益地獲得高純度的海藻有效成分及其對(duì)照品極為迫切.借助超臨界流體提取、加壓溶劑提取、微波輔助提取等快速高效的提取技術(shù)以及高效的制備液相色譜、高速逆流色譜純化技術(shù),開展海藻等天然產(chǎn)物有效成分的分離純化技術(shù)研究,將會(huì)大大促進(jìn)海藻類天然產(chǎn)物的開發(fā)和應(yīng)用,為我國的經(jīng)濟(jì)發(fā)展和人類健康做出更大的貢獻(xiàn).

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Advance of Separation and Purification Techniques for Active Components from Algae

SIXiao-xi1, YUAN Zhi-quan1, Q IU He-yuan1,2, XIAO Xiao-hua1＊, L IGong-ke1＊

(1.SchoolofChemistryandChemicalEngineering,SunYat-senUniversity,Guangzhou510275,China;

2.DepartmentofChemistry,HanshanNormalUniversity,Chaozhou521041,China)

Separation and purification of active components from algae are great significant to the development of algal natural p roducts and ne wdrugs.The recent advance on the extraction,separation and purification techniques for the algae active components are summarized and reviewed in this paper.Especially,the application p rogress of extraction techniques fo r polysaccharide,lipid,pigment,polyphenol and terpene in algae including solvent extraction,supercritical fluid extraction,p ressurized liquid extraction,ultrasonic-assisted extraction and microwave-assisted extraction are summarized.Moreover,the commonly used separation techniques for these active components in algae such as p reparative liquid chromatography and high-speed countercurrent chromatography are also introduced.

algae;active components;extraction;separation and purification

O658.9

A

1004-4353(2011)02-0103-08

2011-04-23

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(20905080);廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目資助課

題(2009B010900021,2010B030600012)

＊通信作者:肖小華(1978—),男,副教授,研究方向?yàn)槭称钒踩治?李攻科(1963—),女,教授,研究方向?yàn)閺?fù)雜體系分離分析.