朱 艷，孫 偉，秦民堅(jiān)*，張朝鳳*

［1.中國(guó)藥科大學(xué)中藥學(xué)院，江蘇南京211198;2.無(wú)限極(中國(guó))有限公司，廣東廣州510665］

黃精屬Polygonatum隸屬于百合科Liliaceae，由Miller 1754年建立，迄今已發(fā)表60余種，廣布于北溫帶，主要分布于喜馬拉雅到日本一帶，中國(guó)約39種，其中20種為我國(guó)特有種?！吨腥A人民共和國(guó)藥典》(2010年版一部)收載本屬中藥材黃精(滇黃精Polygonatum kingianum Coll.et Hemsl.，黃 精 P.sibiricum Red.，多花黃精 P.cyrtonema Hua.)和玉竹Polygonatum odoratum(Mill.)Druce［1］，而民間藥用來(lái)源較為復(fù)雜，有近十幾種。1875年Baker［2］根據(jù)葉序?qū)ⅫS精屬分為互生葉類Alternifolia、輪生葉類Verticillata和對(duì)生葉類Oppositifolia，由于各類群間性狀交叉，地理分布區(qū)重疊，該屬的分類一直存在爭(zhēng)議［3］，隨著新類群和變異型不斷發(fā)現(xiàn)［4］，該屬至今沒(méi)有統(tǒng)一的分類系統(tǒng)，導(dǎo)致同屬常用中藥材黃精和玉竹的原植物鑒定困難和應(yīng)用混亂。

隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展，從分子水平來(lái)探索黃精屬系統(tǒng)問(wèn)題已經(jīng)成為可能，如:Tamura等［5］對(duì)黃精屬17種及1變種的trnk基因進(jìn)行PCR、RFLP分析，支持將黃精屬分成兩組的觀點(diǎn);吳世安等［6］對(duì)黃精屬植物trnk基因和rpl16基因進(jìn)行進(jìn)行PCR、RFLP分析，認(rèn)為互生葉種類組成了一單系，而輪生葉和對(duì)生葉種類為多系關(guān)系，不構(gòu)成一個(gè)單系;近年來(lái)，多篇文獻(xiàn)報(bào)道［7－9］利用 RAPD技術(shù)鑒定玉竹類藥材，周曄等［10］對(duì)黃精屬部分藥用植物親緣關(guān)系進(jìn)行探討，發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地的玉竹、小玉竹和多花黃精出現(xiàn)一定的變異。本文在前人研究的基礎(chǔ)上，通過(guò)RAPD技術(shù)對(duì)黃精屬部分藥用植物的親緣關(guān)系進(jìn)行分析，首次報(bào)道了狹葉黃精，長(zhǎng)梗黃精、湖北黃精在此系統(tǒng)樹(shù)中的位置，利用RAPD技術(shù)對(duì)黃精屬藥用植物進(jìn)行DNA指紋圖譜研究，以期從遺傳學(xué)角度為黃精屬屬內(nèi)關(guān)系和種的鑒別提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

共20批樣品，黃精屬藥用植物19批(6種)，原植物均采集人鑒定，由安徽師范大學(xué)趙麗琴老師和中國(guó)藥科大學(xué)張朝鳳老師協(xié)助審核，將百合科萬(wàn)壽竹屬的寶鐸草(Disporum sessile D.Don)設(shè)定為外類群進(jìn)行試驗(yàn)結(jié)果的聚類分析，以上實(shí)驗(yàn)材料均于2010年7月至2011年3月間采自江蘇、安徽、昆明、湖北、吉林等地，每個(gè)樣品隨機(jī)取樣10株，于－20℃冰箱保存。具體來(lái)源見(jiàn)表1，憑證標(biāo)本保存于中國(guó)藥科大學(xué)中藥資源教研室。

表1 用于RAPD分析的原植物來(lái)源

1.2 方法

1.2.1 總DNA的提取

參照改良 CTAB法［11］，稍加改動(dòng)，具體如下:植物材料經(jīng)蒸餾水洗凈后用吸水紙吸干，剪碎，在研缽內(nèi)用液氮冷卻碾碎成細(xì)粉。取200 mg材料置于1.5 mL的離心管內(nèi)，加入65℃預(yù)熱的提取液1 mL，置65℃水浴，并不斷震搖，提取40 min。室溫，8 000 r/min離心10 min。吸取上清液至另一1.5 mL的離心管中，加入等體積的氯仿－異戊醇(24∶1)萃取液，輕輕顛倒混勻。室溫，10 000 r/min離心10 min，小心吸取上清液至另一離心管中，重復(fù)上述步驟2～3次，直至兩相間的蛋白質(zhì)除盡。吸取上清液至另一干凈的離心管中，加入0.7倍體積預(yù)冷的異丙醇，－20℃放置1 h。4℃ ，12 000 r/min離心20 min。棄去上清液，沉淀用70%乙醇300 μL漂洗2次，4℃，12 000 r/min離心5 min，棄去上清液。室溫風(fēng)干，用50 μL雙蒸水溶解DNA，4℃保存待用。

1.2.2 PCR 反應(yīng)

PCR反應(yīng)體系的總體積為25μL，包括10×PCR buffer 2.5 μL，25 mmol·L－1MgCl22.5 μL，2.5 mmol·L－1dNTP 2.5 μL，10 mmol·L－1引物 1.0 μL，Taq DNA 聚合酶 0.2 μL，Template DNA 5 ～10 ng，ddH2O 補(bǔ)足至 25 μL。

擴(kuò)增程序?yàn)?94℃預(yù)變性3 min，94℃變性50 s，36℃復(fù)性50 s，72℃延伸100 s，40 個(gè)循環(huán)后，72℃延伸5 min。以ddH2O代替模板DNA作空白對(duì)照。擴(kuò)增產(chǎn)物以于1.5%瓊脂糖凝膠上，用1×TAE電泳緩沖液電泳，紫外檢測(cè)電泳結(jié)果并拍照。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

對(duì)凝膠紫外成像系統(tǒng)中重復(fù)性好且清晰的條帶進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以DNA Marker DL2000作分子量標(biāo)記，比較反應(yīng)條帶在凝膠上的遷移率，將遷移率相同的條帶視為同源位點(diǎn)，得到［1，0］數(shù)據(jù)矩陣(有條帶計(jì)為“1”，無(wú)條帶計(jì)為“0”)，用 SPSS分析軟件中的Jaccard方法計(jì)算黃精屬藥用植物及寶鐸草的相似系數(shù)，用Withingroups linkage方法進(jìn)行聚類分析，建立黃精屬藥用植物的親緣關(guān)系樹(shù)狀圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 RAPD 擴(kuò)增

隨機(jī)選擇1份樣品，分別用50條10bp隨機(jī)引物(上海生工生物技術(shù)有限公司合成)進(jìn)行引物初篩，從50條引物中篩選出譜帶清晰且多態(tài)性較好的引物進(jìn)行復(fù)篩，最終篩選出7條擴(kuò)增條帶清晰、反應(yīng)穩(wěn)定且多態(tài)性較好的隨機(jī)引物用于黃精屬植物的RAPD分析，其中引物S51的擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖1。7條RAPD隨機(jī)引物的序列及其擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)表2，由表2可見(jiàn)，7條引物共擴(kuò)增出條帶48條，其中多態(tài)性條帶37條，平均多態(tài)性條帶百分率達(dá)77.1%，擴(kuò)增產(chǎn)物多集中在200～2000 bp。

圖1 引物S51的RAPD擴(kuò)增圖譜

表2 用于RAPD分析的引物序列及擴(kuò)增結(jié)果

2.2 聚類分析

根據(jù)RAPD結(jié)果計(jì)算供試的黃精屬藥用植物及寶鐸草間的相似系數(shù)，可以看出寶鐸草與黃精屬藥用植物的相似系數(shù)非常低，其中與安徽霍山的長(zhǎng)梗黃精相似系數(shù)最低，為0.077，與中國(guó)藥科大學(xué)藥用植物園的玉竹相似系數(shù)最高，也僅為0.190。黃精屬藥用植物與寶鐸草的聚類分析結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 基于RAPD分析的黃精屬部分藥用植物聚類圖

取λ=14，供試的樣品被明顯分為兩大類，黃精屬的藥用植物全部聚為一類(C類)，而寶鐸草單獨(dú)聚為一類，從分子水平論證了寶鐸草被劃歸于百合科萬(wàn)壽竹屬，而不是黃精屬。這也從一定程度上說(shuō)明了黃精屬在“屬”一級(jí)上的分類特征比較清晰，與近緣類群容易區(qū)分，是公認(rèn)的比較自然的屬。取λ=7.5處，黃精屬藥用植物被分為4類，聚類圖上出現(xiàn)交叉現(xiàn)象，來(lái)自湖北赤壁的湖北黃精，安徽六安霍山的長(zhǎng)梗黃精沒(méi)有與其它的黃精屬藥用植物聚在一起，而是各自單獨(dú)作為一類，說(shuō)明這兩種植物與黃精屬的其它藥用植物之間的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。不同產(chǎn)地的玉竹基本上聚在一起，λ=5.5處，玉竹與來(lái)自南京、安徽的多花黃精聚在一起(B類)，但是來(lái)自浙江天目山的多花黃精卻聚到了不同產(chǎn)地的黃精這一支(A類);來(lái)自昆明的4種黃精與陜西黃精聚在一起，而來(lái)自廣西桂林、云南富民、南京中山植物園的黃精與吉林的狹葉黃精卻聚在一起，從中可以看出部分種類在地理分布上相互重疊，種的界限相對(duì)比較模糊。

3 討論

黃精屬藥用植物的分類一直是個(gè)難題，特別是近年來(lái)新種的發(fā)表［12］，更增添了分類與鑒定的困難，這從黃精屬部分藥用植物的聚類圖上可窺見(jiàn)一斑。從我們收集的黃精屬藥用植物的形態(tài)外觀來(lái)看，來(lái)自陜西渭南的黃精與來(lái)自吉林長(zhǎng)白山的狹葉黃精均為輪生葉，在λ=5處并未聚為一類，而在λ=7.5處與其它來(lái)自不同產(chǎn)地的黃精聚為A類，這可能從一定程度上說(shuō)明了互生葉系與輪生葉系的某些植物中的某些形態(tài)上已存在差異減小的現(xiàn)象，這也印證了吳世安［6］認(rèn)為黃精屬仍處在比較活躍的分化期的觀點(diǎn)。

湖北黃精根莖味苦，不能入藥，長(zhǎng)梗黃精一直以來(lái)被視為黃精的摻偽品，誤食不但不能達(dá)到臨床療效，甚至引發(fā)中毒，兩者各自單獨(dú)聚為1類，從而很好地與黃精屬其它藥用植物區(qū)別開(kāi)來(lái)。

RAPD分析用于分類和鑒定，有其獨(dú)到的優(yōu)勢(shì)，可在不知道目的基因序列的情況下產(chǎn)生豐富的DNA多態(tài)性［13－14］，因此被成功地運(yùn)用于動(dòng)植物藥材品種鑒定、原植物的種屬特異性研究、易混淆品種的鑒別許多方面。長(zhǎng)梗黃精和湖北黃精在植物形態(tài)均為互生葉，利用RAPD技術(shù)分可明顯的區(qū)分這兩個(gè)非藥源品種，首次確定了包括狹葉黃精在內(nèi)3個(gè)非藥源植物與《中國(guó)藥典》記載的黃精、多花黃精以及玉竹之間的親緣關(guān)系，認(rèn)為來(lái)自云南昆明的4種黃精與陜西的黃精親緣關(guān)系比較接近，而廣西桂林、云南富民、南京中山植物園、吉林長(zhǎng)白山的狹葉黃精親緣關(guān)系比較接近，至于來(lái)自浙江天目山的多花黃精為何沒(méi)有與產(chǎn)自安徽六安霍山、南京的多花黃精聚在一起，有待采用其它分子生物學(xué)方法來(lái)進(jìn)行更深入的研究。

［1］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典(一部)［M］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2005:288，78.

［2］Baker J D.Revision of the genera and species of Asparagaceae［J］.Linn Soc Bot，1875，14:508－632.

［3］Jeffrey C.The genus Polygonatum(Liliaceae)in Eastern Asia［J］.Kew Bull，1980，34(3):435－471.

［4］中國(guó)科學(xué)院中國(guó)植物志編輯委員會(huì).中國(guó)植物志.第十五卷［M］.北京:科學(xué)出版社，1978:52－80.

［5］Tamura M N ，Schwarzbach A E，Kruse S et al.Biosystematic studies on the genus Polygonatum(Convallariaceae)［J］.Molecular phylogenetic analysis based on restriction site mapping of the chloroplast gene trnk.Feddes Report，1997，108(3－4):159－168.

［6］吳世安，呂海亮，楊 繼，等.葉綠體DNA片段的RFLP分析在黃精族系統(tǒng)學(xué)研究中的應(yīng)用［J］.植物分類學(xué)報(bào)，2000，38(2):97－110.

［7］劉塔斯，李 鐘，劉春林.玉竹及其混淆產(chǎn)品黃精的RAPD分析［J］.中國(guó)藥學(xué)雜志，2002，37(10):734－736.

［8］王潤(rùn)玲，唐 鋮，周 曄，等.玉竹及其摻偽品的 RAPD鑒定［J］.中草藥，2006，37(11):1727－1729.

［9］李新娥.用RAPD技術(shù)鑒別湖南道地藥材玉竹［J］.中醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2010，16(9):97－98.

［10］周 曄，唐 鋮，張 攻等.隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DMA技術(shù)與簡(jiǎn)單序列重復(fù)標(biāo)記法探討部分黃精屬藥用植物親緣關(guān)系的研究［J］.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2008，19(7):1646－1647.

［11］Clark M S.植物分子生物學(xué)－實(shí)驗(yàn)手冊(cè)［M］.顧紅雅，禮 嘉主譯.北京:高等教育出版社，1998:3－7.

［12］吳珍蘭，楊永昌.青海黃精屬一新種［J］.西北植物學(xué)報(bào)，2005(10):2088－2089.

［13］Williams J G K，Kubelik A R，Kenneth J L，et al.DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers［J］.Nucleic Acids Research，1990，18(22):6531－6535.

［14］Welsh J，Moclewomd M.Fingerp rinting genome using PCR with arbitrary primers［J］.Nucleic Acids Research，1990，18:7213－7218.