臘梅葉揮發(fā)性成分及其抑菌活性研究

劉祝祥，賀建武，彭德嬌，向 芬，石進(jìn)校

（吉首大學(xué)植物資源保護(hù)與利用湖南省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，生物資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，湖南 吉首 416000）

臘梅（Chimonanthus praecox）隸屬臘梅科（Calycanthaceae），為第四紀(jì)冰川孑遺植物[1]，是我國(guó)特有的傳統(tǒng)名花和經(jīng)濟(jì)樹種，秦嶺以南和橫斷山脈以東為其現(xiàn)代分布中心[2]。臘梅花、葉、莖、根均能入藥，具有解暑生津，鎮(zhèn)咳止痰的功效[3]。刁軍成等[4]對(duì)臘梅的同屬植物山臘梅葉進(jìn)行了抑菌研究，發(fā)現(xiàn)其溫?zé)嵴舭l(fā)物對(duì)金黃色葡萄球菌有較強(qiáng)的抑制作用，并且水提取液能直接抑制流感病毒。朱華年等[5]研究發(fā)現(xiàn)臘梅葉的甲醇提取物具有一定的清除自由基活性。目前，對(duì)臘梅葉揮發(fā)性成分及其抑菌活性等方面的研究未見文獻(xiàn)報(bào)道，為綜合開發(fā)利用臘梅資源，本文采用超臨界CO2流體萃取技術(shù)萃取臘梅葉揮發(fā)性成分，結(jié)合GC-MS聯(lián)用技術(shù)對(duì)揮發(fā)性成分進(jìn)行分離和鑒定，并對(duì)其抑菌活性進(jìn)行了研究，以期為臘梅的利用提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)樣品 野生臘梅葉采于吉首德夯，臘梅由吉首大學(xué)生物資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院陳功錫教授鑒定為臘梅科臘梅屬臘梅。采集好的臘梅葉經(jīng)45℃低溫烘干，碾碎備用。

1.1.2 儀器與試劑 華安HA121-50-1型超臨界流體萃取裝置（江蘇南通華安超臨界流體萃取有限公司）；氣質(zhì)聯(lián)用器：GCMS-QP2010（日本島津，配NIST2005標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜庫）。所用試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3 抑菌指示菌與培養(yǎng)基 用于抑菌實(shí)驗(yàn)的8個(gè)敏感指示菌為：枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大腸桿菌（Escherichia coli）、藤黃八疊球菌（Sarcina lutea）、黑曲霉（Asperillus niger）、產(chǎn)氣腸桿菌（Enterobacter aerogenes）、變形桿菌（Proteus vulgaris）、白色念珠球菌（Candida albicans），由吉首大學(xué)微生物資源與生態(tài)實(shí)驗(yàn)室保藏。培養(yǎng)基為營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基。

1.2 方法

1.2.1 揮發(fā)性成分超臨界CO2流體萃取 稱取臘梅葉干粉500 g裝入料筒，放進(jìn)萃取釜，按工藝要求開啟萃取裝置，調(diào)節(jié)萃取溫度為35℃、萃取壓力25 Mpa、CO2流量 15 L/min，待制冷系統(tǒng)、萃取溫度和CO2流量穩(wěn)定后，開動(dòng)高壓泵進(jìn)行循環(huán)萃取。從鋼瓶出來的CO2經(jīng)過濾系統(tǒng)和制冷系統(tǒng)后，經(jīng)高壓泵達(dá)所需壓力，由預(yù)熱系統(tǒng)升至所需溫度后，與原料接觸，被萃取成分溶解在CO2中，萃取物流入分離系統(tǒng)，萃取時(shí)間為3 h，改變壓力，降低萃取物在超臨界CO2中的溶解度而析出，萃取物用收集瓶接收，CO2氣體經(jīng)系統(tǒng)循環(huán)利用。

1.2.2 揮發(fā)性成分GC-MS分析 色譜柱為RTX-5MS彈性毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；程序升溫：柱起始溫度60℃，保持1 min，以10℃/min的速率升至160℃，保持4 min，再以5℃/min的速率升至260℃，保持5 min；進(jìn)樣口溫度250℃；載氣（氦氣）流量為 1 mL/min；進(jìn)樣量 0.5 μL，分流比為 1:30。質(zhì)譜條件：EI離子源，電子能量70 eV，離子源溫度：200℃，接口溫度230℃，掃描范圍29～450 amu。

1.2.3 抗菌活性的測(cè)定[6]采用濾紙片瓊脂擴(kuò)散法測(cè)定臘梅葉揮發(fā)性成分的抗菌活性，取八種指示菌分別接種于培養(yǎng)基中，混合倒平板，待培養(yǎng)基凝固，在超凈工作臺(tái)上分別取兩片蘸有臘梅葉揮發(fā)性成分的小紙片貼在含有指示菌的培養(yǎng)基表面。置于恒溫培養(yǎng)箱中，28℃培養(yǎng)48 h后觀察抑菌圈大小。重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 超臨界CO2流體萃取結(jié)果

按照上述萃取條件，經(jīng)過3 h萃取，共得到約3 mL油狀物。

2.2 GC-MS分析結(jié)果

用GC-MS技術(shù)對(duì)臘梅葉揮發(fā)性成分進(jìn)行分離和鑒定，總離子流圖見圖1。對(duì)總離子流圖中的各峰經(jīng)積分，按峰面積歸一化法確定各組分相對(duì)含量，并結(jié)合NIST2005標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜庫，對(duì)各峰進(jìn)行鑒定，結(jié)果見表1。

圖1 臘梅葉揮發(fā)性成分GC-MS總離子流圖

由表1可知，通過GC-MS技術(shù)分離和鑒定，臘梅葉揮發(fā)性成分中共鑒定出25種化學(xué)成分，占揮發(fā)性成分相對(duì)含量的98.47%，主要為稠環(huán)芳烴、烷烴、醇、烯、酚、酯和少量脂肪酸。其中醇相對(duì)含量占37.75%、烷烴相對(duì)含量占28.58%、烯烴相對(duì)含量占11.15%、稠環(huán)芳烴萘占10.23%、酯相對(duì)含量占4.31%，酚相對(duì)含量占2.84%，還含有少量的脂肪酸。

2.3 活性測(cè)定結(jié)果

以濾紙片瓊脂擴(kuò)散法測(cè)定臘梅葉超臨界CO2萃取物的揮發(fā)性成分的抗菌活性，結(jié)果表明揮發(fā)性成分對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、變形桿菌均有抑菌現(xiàn)象（表2），其中對(duì)金黃色葡萄球菌的抗菌效果最佳。

3 小結(jié)與討論

利用超臨界CO2流體萃取技術(shù)，部分脂溶性化合物在CO2籠罩下進(jìn)行提取，可以有效地防止熱敏及光敏性物質(zhì)的氧化和逸散[7]，比常規(guī)的水蒸氣蒸餾法能更好地萃取臘梅葉的揮發(fā)性化學(xué)成分。通過GC-MS聯(lián)用技術(shù)分離鑒定出臘梅葉揮發(fā)性化學(xué)成分，主要有稠環(huán)芳烴、烷烴、醇、烯、酚、酯和少量脂肪酸物質(zhì)。臘梅葉揮發(fā)性化學(xué)成分中環(huán)扁桃酯是一種能改善血流變及血栓形成的有效化合物[8]；2,4-二叔丁基苯酚是制備抗氧化劑的重要中間體[9]；葉綠醇能有效降低血清總膽固醇與低密度脂蛋白膽固醇的含量[10]；β-波旁烯我們?cè)谘芯颗D梅籽化學(xué)成分中也有報(bào)道；β-欖香烯體內(nèi)外均有顯著的抗腫瘤作用，可有效誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡；鄰苯二甲酸酯有抗氧化、抗癌、抗菌及驅(qū)蟲避蚊等活性。抑菌結(jié)果表明，臘梅葉揮發(fā)性成分抗菌譜廣，對(duì)金黃色葡萄球菌的抗菌效果明顯，從中鑒定出來的重要化合物，具有抗菌、抗癌等生物活性。臘梅葉作為傳統(tǒng)消炎殺菌藥物，可能與這些抑菌成分有關(guān)。上述結(jié)果表明，臘梅葉具有較重要的價(jià)值，值得進(jìn)一步研究以促進(jìn)其在醫(yī)藥和農(nóng)業(yè)上的利用。

表1 臘梅葉揮發(fā)性成分GC-MS分析結(jié)果

表2 臘梅葉揮發(fā)性成分抑菌試驗(yàn)結(jié)果

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