申湘忠
(湖南人文科技學(xué)院化學(xué)與材料科學(xué)系,湖南 婁底 417000)
粽葉分兩種,一種葦葉,另一種箬葉,主要分布于長江以南各省丘陵地區(qū)。在我國南方大部分地區(qū)一直用箬葉包粽子,就是利用其特殊的竹香味和防腐作用。它含有大量對人體有益的葉綠素和多種氨基酸等成份,可提取天然香精香料和食品添加劑,還可用于包裝其他的食品及作餐桌上的裝飾和食物的陪襯。
多糖是所有生命有機(jī)體的重要組成部分,廣泛存在于動(dòng)物、植物和微生物細(xì)胞壁中,是生物體內(nèi)除核酸和蛋白質(zhì)以外的又一類重要的生物分子??茖W(xué)研究已經(jīng)確認(rèn)糖類物質(zhì)具有許多生物活性,包括抗腫瘤、免疫、降血糖和抗病毒等。中藥多糖因具有增強(qiáng)機(jī)體免疫功能及抗腫瘤降血糖等藥理作用,而且?guī)缀鯖]有毒性與副作用,因此引起國內(nèi)外藥理學(xué)家、生物學(xué)家和化學(xué)家們的關(guān)注[1-14]。研究以粽葉為原料,通過提取和分離其中的多糖,并對產(chǎn)品進(jìn)行定性分析和光譜分析,為實(shí)際生產(chǎn)提供參考。
試驗(yàn)儀器包括FT-IR360紅外光譜儀(美國尼高力公司);UV-2501分光光度計(jì)(日本島津);7200分光光度計(jì);RE52-05旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器;HH-2電熱恒溫水浴鍋;101-2A電熱鼓風(fēng)干燥箱;HB-Ⅲ循環(huán)式多用真空泵;FA2104(N)系列電子天平;QE-04A大功率粉碎機(jī)。
試驗(yàn)試劑包括石油醚(AR);無水乙醇(AR);濃硫酸(AR);苯酚溶液(6%);標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖(AR);SephadexG-100葡聚糖(AR)。試驗(yàn)材料為粽葉,采集于婁底農(nóng)村。
新鮮粽葉→洗凈晾干→50℃烘干→粉碎→用石油醚回流脫脂→用80%乙醇回流除去單糖和低聚糖等干擾性成分→微波加熱提取→減壓濃縮→sevag法去蛋白→透析→醇析→離心處理→無水乙醇、丙酮、無水乙醚除雜、脫水→sephadexG-100柱層析純化→真空干燥→粽葉多糖純品。
從婁底采集新鮮粽葉若干,洗凈晾干之后放入電熱鼓風(fēng)干燥箱50℃的條件下烘干,烘干之后用手輕輕碾碎然后轉(zhuǎn)入粉碎機(jī)中打成粉末狀,之后過篩取55目粽葉粉保存于干燥的棕色試劑瓶中待用。
取粽葉粉末50 g,加入一定體積的石油醚脫脂,殘?jiān)L(fēng)干。殘?jiān)僖?0倍體積的95%乙醇水浴回流2次,每次3 h,溫度為90℃?;厥找掖迹〕鰵?jiān)?,使溶劑于空氣中自然揮發(fā)。在殘?jiān)屑尤?00 mL蒸餾水,于90℃水浴中回流提取,重復(fù)3次,各次提取時(shí)間分別為2.5、2、1.5 h。每次提取后均趁熱過濾,合并3次濾液為粗提液(約500 mL),取1.0 mL測吸光度,計(jì)算多糖含量。將粗提液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮。
sevage法去蛋白:根據(jù)蛋白質(zhì)在氯仿等有機(jī)溶劑中變性的特點(diǎn),按多糖溶液∶氯仿∶正丁醇=1∶0.2∶0.04的比例混勻,劇烈振搖20~30 min,蛋白質(zhì)與氯仿-正丁醇生成凝膠物而分離,離心,分去水層和溶劑層交界處的變性蛋白質(zhì),反復(fù)多次,直至沒有凝膠物生成為止。收集上層溶液。脫蛋白后的濃縮液用流動(dòng)自來水透析72 h,蒸餾水透析24 h。醇析所得的沉淀物,加無水乙醇混勻,離心處理重復(fù)3次,再分別用丙酮、乙醚洗滌2遍。50℃真空干燥[4]。計(jì)算得率。
稱取0.3 g粽葉多糖配成10 mL溶液,經(jīng)SephadexG-100柱層析(4.5 cm×80 cm),用 0.1~1.0 mol/L NaCl溶液洗脫,流速0.7 mL/min,用收集洗脫液[1],旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)減壓濃縮至30 mL,加乙醇沉淀,4℃放置過夜,離心分離出沉淀物。40℃真空干燥得純化后的多糖純品。
精確稱取干燥至恒重的無水葡萄糖10.00 mg,置100 mL容量瓶中,加水溶解后定容至刻度制成貯備液,分別取上述葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mL 于 8 支比色管中,加水定容至2 mL,再分別加入6%的苯酚溶液及5 mL的濃H2SO4,靜置10 min之后搖勻,再靜置冷卻至室溫。以蒸餾水為空白,在488 nm波長處測定吸光度。以葡萄糖的含量為橫坐標(biāo),吸光值為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。
精確稱取干燥至恒重的粽葉多糖白色無定形粉末0.025 g,置于250 mL容量瓶中,加水定容至刻度,搖勻得到精制多糖樣品溶液,濃度為0.1 mg/mL,測定吸光度,由回歸方程計(jì)算出供試液中的葡萄糖含量,按下式計(jì)算換算因子。
換算因子f=W/(C×D)
式中:W為稱取多糖的重量(mg),C為多糖液中葡萄糖的含量(mg/mL),D為多糖的稀釋倍數(shù)。
精確吸取樣品溶液1.0 mL,置于100 mL容量瓶中,用蒸餾水定容至刻度,取1.0 mL于比色管中,測定吸光度,由回歸方程計(jì)算出供試液中葡萄糖含量,按下式計(jì)算各樣品中多糖的含量分?jǐn)?shù)。
多糖的含量分?jǐn)?shù)(%)=C×D×f/(W×1 000)
式中:C為樣品溶液中葡萄糖的含量(mg/mL),D為樣品溶液的稀釋倍數(shù),f為分別加入水、乙醇、甲苯、氯仿、丙酮等溶劑中,觀察粽葉多糖在這些溶劑中的溶解換算因子,W為樣品重量(g)。
溶解試驗(yàn):取少量粽葉多糖分別加入水、乙醇、甲苯、氯仿、丙酮等溶劑中,觀察其在這些溶劑中的溶解情況。
Molish反應(yīng):取1 mL濃度為1 mg/mL的粽葉多糖溶液加入2滴Molish試劑,搖勻,將試管傾斜,沿試管壁慢慢加入1.0 mL濃硫酸,豎直試管,觀察濃硫酸和糖溶液交界面顏色的變化。糖在濃硫酸的作用下脫水形成糠醛及其衍生物與α-萘酚作用形成紫紅色復(fù)合物,在糖液和濃硫酸的液面間形成紫環(huán),因此又稱紫環(huán)反應(yīng)。
茚三酮反應(yīng):取1 mL濃度為1 mg/mL的粽葉多糖溶液,加入0.5 mL的2.5%茚三酮乙醇溶液,混勻,煮沸2 min,冷卻,觀察顏色變化。以蒸餾水作陰性對照,0.5%甘氨酸溶液作陽性對照。
紫外光譜:稱取干粽葉多糖樣品6.0 mg,加20 mL雙蒸水溶解配成0.3 mg/mL的多糖溶液,在200~400 nm區(qū)間進(jìn)行掃描。
紅外光譜:稱取干粽葉多糖樣品2 mg,加入200 mg干燥的KBr晶體,在紅外燈照射下于研缽中輕輕研磨至極細(xì),用壓光機(jī)壓片,經(jīng)紅外分光光度計(jì)400~4 000 cm-1中紅外區(qū)掃描,測定透光率曲線。
在489 nm下測定其吸光度與葡萄糖含量的關(guān)系曲線,如圖1。
圖1 葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線
用最小二乘法線性回歸[10],得多糖濃度與吸光度A的關(guān)系:
C=0.001 155+30.8 A
式中C為由計(jì)算的多糖濃度(mg/mL),A為測得的吸光度值。
粽葉多糖呈灰白色粉末狀,溶于水,不溶于乙醇、甲苯、氯仿、丙酮等有機(jī)溶劑,粽葉多糖在Molish反應(yīng)中產(chǎn)生紫色環(huán),說明樣品溶液中含糖。茚三酮反應(yīng)弱陽性,說明粽葉多糖樣品中存在少量的氨基酸或多肽類物質(zhì)。
脫蛋白質(zhì)后真空干燥得1.76 g;得率為2.52%。換算因子為:2.50;測得粽葉提取液中多糖的含量為3.99%。
掃描結(jié)果見圖2~4。圖2為多糖提取液的紫外光譜圖。260 nm~280 nm處有明顯的吸收峰,說明含有一定量的蛋白質(zhì)和氨基酸分子。圖3為使用Sevag法去蛋白之后的紫外光譜圖。掃描結(jié)果顯示0.3 g/L的粽葉多糖水溶液在波長260 nm處有一個(gè)小的吸收峰圖。分析原因可能為氯仿聯(lián)合正丁醇已經(jīng)去掉了部分蛋白。圖4為粽葉多糖用透析聯(lián)合Sevag法去蛋白之后的紫外光譜掃描結(jié)果,顯示0.3 g/L的粽葉多糖水溶液在波長260 nm~280 nm處幾乎沒有吸收峰,由此可見透析聯(lián)合Sevag法去蛋白的效果明顯。
圖2 未去蛋白粽葉多糖水溶液紫外光譜圖
圖3 Sevag法去蛋白后的紫外光譜圖
圖4 透析聯(lián)合Sevag法去蛋白的紫外光譜圖
由紫外光譜圖譜對照可知,在260 nm~280 nm處的吸收峰逐漸變小,說明蛋白質(zhì)和氨基酸分子含量很少。
粽葉多糖紅外光譜分析結(jié)果見圖5~7。
從以上紅外光譜可知,粽葉多糖組分在3 600~3 200 cm-1、3 200~2 800 cm-1、1 400~1 200 cm-1、和1 200~1 000 cm-1這個(gè)譜段內(nèi)都出現(xiàn)了典型多糖物質(zhì)的吸收峰。粽葉多糖的紅光譜掃描結(jié)果顯示:在3 470 cm-1處出現(xiàn)一寬峰,為O-H的伸縮振動(dòng);2 940 cm-1的吸收峰較弱,是C-H伸縮振動(dòng);1 620 cm-1處的吸收峰為-CHO的C=O伸縮振動(dòng);1 320 cm-1和1 260 cm-1處為C-H的變角振動(dòng)吸收峰;1 040 cm-1和960 cm-1處為吡喃環(huán)結(jié)構(gòu)的C-O和羥基的吸收峰;890 cm-1吸收峰是β2型C-H變角振動(dòng)的特征吸收峰;820 cm-1是α-D-半乳吡喃糖的特征吸收峰。
圖5 醇析多糖紅外光譜圖
圖6 醇析-透析多糖紅外光譜圖
圖7 粗多糖紅外光譜圖
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