耐酸性脂肪酶產生菌的篩選及酶學性質研究

王 琰 張志敏 王 斌 萬 一

耐酸性脂肪酶產生菌的篩選及酶學性質研究

王 琰 張志敏 王 斌 萬 一

從西安市周邊及秦巴山區(qū)采集的165份土樣中，分離篩選到200余株脂肪酶產生菌（包括細菌、霉菌及酵母等）；通過酸性三丁酸甘油酯平板法篩選到10株耐酸性的脂肪酶菌株，對其中一株酶活較高的真菌FL002進行酶學性質初步研究；經18S rDNA的克隆與序列分析，初步鑒定FL002為地霉屬（Galactomyces geotrichum）。結果表明，目前已經初步建立了具有陜西特色的微生物脂肪酶菌種庫，建立了酸性脂肪酶產生菌的篩選模型；從FL002菌中獲得的脂肪酶具有耐高溫和耐酸特性，該菌及該菌產生的脂肪酶有望應用于飼料行業(yè)。

白地霉；脂肪酶；耐高溫；耐酸；飼料

脂肪酶（lipase E.C.3.1.1.3）是一種分解脂肪的酶類，在食品、化工、醫(yī)藥、皮革、生物能源等工業(yè)領域已獲得廣泛應用。近幾年，脂肪酶在非水相酶學的研究中取得進展，使其成為應用最廣泛的生物催化劑之一。脂肪酶廣泛存在于動植物和微生物，其中微生物脂肪酶以其用途廣、易于大規(guī)模生產及純化等優(yōu)點而成為工業(yè)脂肪酶的重要來源[1-4]。地霉屬（Galactomyces geotrichum）微生物是脂肪酶的重要生產菌，目前，從地霉菌中分離到20多種脂肪酶，部分已形成商品化的酶制劑[5-6]。不同來源的脂肪酶在選擇性上有所不同，其中地霉屬脂肪酶大多具有良好的立體選擇性、較高的轉化率和穩(wěn)定性等優(yōu)點，因而在手性化合物、生物柴油、芳香酯的制備以及飼料用酶制劑的開發(fā)等方面受到廣泛關注[7-8]。

近年來，酶制劑一直是國內外動物營養(yǎng)研究的熱點之一。它們在飼料工業(yè)中的有效應用使得飼料工業(yè)和養(yǎng)殖業(yè)安全、高效、環(huán)保和可持續(xù)發(fā)展成為可能。研究發(fā)現(xiàn)，微生物脂肪酶可提高斷奶仔豬的生產性能，減輕斷奶仔禽、仔畜的營養(yǎng)應激[9]。在飼料中添加外源性脂肪酶能補充動物特殊生理階段內源酶的不足，提高飼料脂肪的消化；同時，對動物體內內源消化酶的分泌有一定的促進作用，并有利于營養(yǎng)物質的消化分解和吸收利用[10]。另外，脂肪酶水解脂肪產生的脂肪酸還能抑制消化道內有害微生物的生長。因此，脂肪酶作為酶制劑在飼料行業(yè)中有著廣泛的研究潛力和應用前景，但目前在國內外還處于起步階段。

本研究是從西安市周邊地區(qū)及秦巴山區(qū)采集的土樣中，篩選微生物脂肪酶產生菌，建立具有陜西特色的脂肪酶菌種庫，為脂肪酶的開發(fā)和應用奠定基礎。針對脂肪酶在飼料行業(yè)應用中存在的問題，篩選具有溫度耐受性的酸性脂肪酶產生菌，并對獲得的脂肪酶的部分酶學性質進行研究，為該菌以及該菌產生的脂肪酶應用于飼料行業(yè)奠定基礎。

1 材料

1.1 土樣采集

從西安周邊油脂廠、化工廠、花生地、油菜地及秦巴山區(qū)等地采集到富含油污的土壤樣本165份，供分離使用。

1.2 菌株和質粒

由本實驗室分離、保存的脂肪酶產生菌株共200余株；E.coli DH5α為本實驗室保存；pGM-T質粒為克隆載體，購自TIANGEN公司。

1.3 培養(yǎng)基

細菌和真菌富集培養(yǎng)基、平板初篩培養(yǎng)基以及復篩培養(yǎng)基參考 Gao L 等（2004）[11]。

1.4 酶和試劑

Taq酶和DNA Marker購自Takara公司；胰蛋白胨、酵母粉、瓊脂糖，購自Oxoid公司；三丁酸甘油酯購自上海晶純實業(yè)有限公司；聚乙烯醇（PVA）[平均聚合度（1 750±50）]購自上海國藥集團；橄欖油為慕氏初榨特級橄欖油，其他試劑均為國產分析純；離心柱型普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、pGM-T連接試劑盒購自TIANGEN公司。

2 方法

2.1 脂肪酶產生菌株的篩選

初篩：采用透明圈平板法篩選脂肪酶產生菌株，操作步驟參考惲麗紅等（2008）[12]。

復篩：將初篩純化后的菌種接于發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃、200 r/min搖床培養(yǎng)48 h,檢測酶活性。

2.2 脂肪酶活力測定

采用橄欖油乳化液水解滴定法，操作步驟參照國標 GB/T23536—2009。

2.3 酸性脂肪酶菌株的篩選

采用酸性三丁酸甘油酯平板鑒定法，即以三丁酸甘油酯乳化液（1%），LB培養(yǎng)基和瓊脂（1.8%），用pH值5.0的乙酸-乙酸鈉緩沖液制成平板，在平板中打孔（直徑約3 mm），每孔加入20 μl脂肪酶菌株培養(yǎng)液，置于30℃恒溫培養(yǎng)箱，定時觀察并測量孔周圍的透明圈大小。根據(jù)菌株是否生長以及菌株透明圈的大小對菌株進行性質分類，以獲得耐酸性及在酸性條件下具有脂肪酶活性的菌株。

將在酸性三丁酸甘油酯平板上生長并且透明圈較大的菌株接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃、200 r/min搖床培養(yǎng)48 h,離心收集發(fā)酵液上清，檢測脂肪酶活性。

2.4 脂肪酶粗品的制備

將FL002菌株發(fā)酵培養(yǎng)48 h，12 000 r/min離心10 min，收集發(fā)酵液上清；往上清液中加入研磨成粉末的硫酸銨至20%飽和度，4℃放置過夜，于4℃下12 000 r/min離心20 min；棄沉淀，收集上清，向上清液中加入硫酸銨粉末至70%飽和度，收集沉淀；用去離子水溶解沉淀，透析處理后冷凍干燥，所得粉末即為脂肪酶粗酶粉。

2.5 脂肪酶酶學性質初步研究

2.5.1 脂肪酶最適反應溫度及溫度穩(wěn)定性

稱取0.50 g粗酶粉溶解于pH值7.5的磷酸緩沖液中，使溶液中酶活力在25 U/ml左右，制備成脂肪酶樣品。脂肪酶的最適溫度是在20～60℃范圍內，每隔5℃檢測脂肪酶的活力。

溫度穩(wěn)定性是將上述脂肪酶樣品在25℃、30℃、35℃、40℃水浴中分別保溫48 h，每隔6 h測定其相對酶活力。

2.5.2 脂肪酶最適pH值及pH值穩(wěn)定性

最適pH值是將上述脂肪酶樣品加入到一定pH值（4.0～8.5，以0.5為梯度）的緩沖液體系中，在最適作用溫度下，測定不同pH值下的脂肪酶活力。

pH值穩(wěn)定性是脂肪酶在不同pH值的緩沖液中，40℃保溫1 h后，在最適作用溫度下，測定脂肪酶的相對酶活力。

2.5.3 金屬離子和表面活性劑對酶活力的影響

將上述脂肪酶樣品分別加入終濃度為10 mM的KCl、MnCl2、FeSO4、CuCl2、CaCl2、ZnCl2、NiCl2、EDTA 和0.1%的 Tween-80、Gum Arabic、PVA、SDS、Triton 100溶液中，40℃下保溫1 h后，測定脂肪酶活力，計算相對酶活。

2.6 菌株的鑒定

2.6.1 18S rDNA片段的PCR擴增

提取FL002菌株的基因組DNA[13]。采用真菌18S rDNA 通用引物（SP1：5-CAACCTGGTTGATCCTGC-3；SP4：5-CTTCCTCTAAATGATCAAG-3），以基因組 DNA為模板擴增18S rDNA。PCR條件為：95℃變性5 min；94 ℃、40 s，55 ℃、40 s，72 ℃、2 min，40 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4℃保存。擴增產物通過1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2.6.2 18S rDNA的克隆和序列分析

PCR產物經純化試劑盒回收后，連接于pGM-T載體上，轉化至感受態(tài)細胞E.coli DH5α中[14]。在NCBI中應用BLAST程序對序列同源性進行比對，得到與之同源性較高的序列，采用Clustal X 1.8進行多序列匹配排序，并通過Mega 4.0軟件對菌株FL002及其近緣屬種進行遺傳距離分析。

3 結果

3.1 脂肪酶菌種庫的初步建立及酸性脂肪酶菌株的篩選

將165份不同來源的土樣進行平板初篩后，得到200余株脂肪酶產生菌，其中細菌約127株，霉菌87株，酵母15株。

通過酸性三丁酸甘油酯平板法對脂肪酶菌種庫進行篩選，得到10株能夠在pH值為5.0的酸性平板上生長并且有明顯水解圈的菌株；將以上10株菌按2%的接種量接于發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃、150 r/min培養(yǎng)48 h后，測定發(fā)酵液上清的脂肪酶活性，其中FL002菌株的酶活最高，達到75.50 U/ml，作為進一步研究對象。

3.2 脂肪酶的酶學性質

3.2.1 酶作用的最適溫度及熱穩(wěn)定性

在20～60℃，間隔為5℃的不同溫度下進行酶活測定，結果表明，該酶在20～35℃酶活力隨著溫度的升高而增大，35℃時酶活力達到最高，40℃酶活力達到最高酶活的90%，超過40℃酶活力迅速下降（見圖1）。

圖1 酶的最適作用溫度

將 FL002脂肪酶樣品在 25、30、35、40 ℃水浴中分別保溫48 h，每隔6 h按前述方法測定酶活力，以不經處理的酶活力為100%，其余所得酶活力折算成百分數(shù)，取6 h和48 h兩時間點對保溫時間作圖（如圖2）。從圖2中可以看出，該酶在40℃保溫6 h不失活，在40℃保溫48 h仍保留80%左右的酶活力，表明該脂肪酶具有一定的熱穩(wěn)定性。

3.2.2 酶作用的最適pH值及pH值穩(wěn)定性

配制8種從pH值 4～8.5，間隔為0.5～1個pH值單位的緩沖液，按照酶活力測定方法，測得相同酶液在不同pH值條件下的酶活力。如圖3，此酶的最適作用pH值在6.5。取酶液與不同pH值（4～8.5）的緩沖液以l：5的比例混合，在40℃時保溫1 h，再將酶液調回到最適pH值，測定酶活，以最適反應pH值下保溫所得的酶活力為100%，其余折合成其剩余酶活力的百分數(shù)。結果表明，此酶在pH值6.0～8.5之間比較穩(wěn)定，在pH值6.0時作用1 h后，仍能保持80%以上的酶活，故此酶有一定的酸度耐受性（如圖4）。

3.2.3 金屬離子和表面活性劑對脂肪酶的影響

FL002脂肪酶在10 mM的金屬離子和0.1%的表面活性劑溶液中作用1 h后，脂肪酶活力變化結果見圖5。其中發(fā)現(xiàn)，微量Cu2+和Ni2+對酶活力有明顯抑制作用，F(xiàn)e2+和Ca2+有一定的抑制作用，金屬螯合劑EDTA對酶活也有抑制作用，其它金屬離子對該酶活力影響不大，表明該酶可能是一個金屬酶。表面活性劑中，0.1%的Triton 100對該酶的活力有明顯增強作用（酶活提高到150.79%），而0.1%的SDS對酶活有強烈的抑制作用（酶活降低至3.17%），PVA和 Gum Arabic對酶活有一定的抑制作用。

圖3 酶反應的最適pH值

圖4 酶的pH值穩(wěn)定性

圖5 金屬離子、表面活性劑及EDTA對脂肪酶活性的影響

3.3 FL002菌株的18SrDNA遺傳系統(tǒng)進化樹分析

將FL002菌株的18S rDNA序列應用BlAST程序進行同源性比對，發(fā)現(xiàn)其18S rDNA序列和多數(shù)Galactomyces geotrichum的同源性為99%；利用Clustal X 1.8和Mega 4.0軟件對菌株FL002及其近緣屬種進行遺傳距離分析，構建系統(tǒng)進化樹如圖6。進化樹上FL002和Galactomyces geotrichum屬于同一簇，因此，可將FL002初步鑒定為Galactomycesgeotrichum。

4 討論

本研究主要針對陜西地區(qū)及秦巴山區(qū)，篩選微生物脂肪酶產生菌，建立具有陜西特色的脂肪酶菌種庫，該庫中包括了細菌、真菌以及酵母等眾多類型的菌株，為篩選具有不同特性的脂肪酶產生菌及其脂肪酶提供了一個良好的平臺，對于脂肪酶多種用途的開發(fā)有很大的實用價值。本文采用酸性三丁酸甘油酯平板法，從目前建立的菌種庫中成功地篩選出耐酸性的脂肪酶菌株。該方法的建立為進一步篩選具有其它性質的脂肪酶或脂肪酶產生菌提供借鑒。

圖6 菌株FL002依據(jù)18S rDNA建立的遺傳進化樹

脂肪的消化主要發(fā)生在十二指腸和小腸，在到達作用位點之前，添加到飼料中的酶制劑首先要經過胃的酸性環(huán)境[10]。因此，飼料用脂肪酶必須對胃腸道的酸性條件有一定耐受性，并且在內源酶作用位點的pH值范圍內具有較高的活性。FL002脂肪酶在pH值6.5酶活力最高，在pH值6.0～8.5之間作用1 h仍具有80%以上的酶活力，因此，在消化道pH值范圍內損失的酶活性較小，比較適合用于飼料的外源酶制劑。家禽體內溫度約為40℃，在40℃時該脂肪酶具有90%的酶活力，在40℃作用6 h酶活力沒有損失，作用48 h后仍能保持80%的脂肪酶活性，說明在畜禽體內就體溫而言比較適合該脂肪酶發(fā)揮作用。動物體內含有多種必需礦物元素，它們在動物機體代謝中具有重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，10 mM的Fe2+和Ca2+對脂肪酶活性有一定程度的抑制作用，其中Cu2+和Ni2+對脂肪酶的抑制相對明顯，這與其他屬脂肪酶的酶學性質研究報道有所不同。如黑曲霉脂肪酶活性受多種金屬離子的抑制，而對Ca2+有明顯的依賴性[15]，而在另外一些關于脂肪酶性質研究中也有類似于本文所得到的實驗結果，表明了不同物種所產脂肪酶在性質上的不同特點[16]。0.1%的SDS對該脂肪酶活性有強烈的抑制作用，而0.1%的Triton-100對該脂肪酶活性有明顯的激活作用，Tween 80對該脂肪酶活性基本沒有影響，更低濃度金屬離子及表面活性的增強或抑制作用有待進一步研究。

目前，脂肪酶在禽、豬、羊、牛飼料中的國內外研究表明，添加該酶釋放出的脂肪酸，可提高油脂飼料原料的能量利用率，增加和改進飼料的風味和香味，改善家畜的食欲。脂肪酶還可清除植物性飼料原料中的脂質抗營養(yǎng)因子，彌補幼禽幼畜消化道內源脂肪酶的不足，緩解“仔豬早期斷奶綜合癥”[17]。Dierick等[18]用4種中鏈脂肪酶組合進行的水解試驗表明，釋放的中鏈脂肪酸對消化道主要有害微生物的生長具有顯著的抑制作用，起到類似抗生素的作用。據(jù)推測，脂肪和脂肪酶的合理組合可能起到降低仔豬飼料中抗生素使用量的作用，使飼料應用更為安全、高效。因此，耐酸性脂肪酶或脂肪酶產生菌作為飼料添加劑在動物養(yǎng)殖中具有很好的應用前景。本文研究的耐酸性脂肪酶經鑒定屬于地霉，該菌株應用于飼料有自己的優(yōu)勢，即其菌體蛋白營養(yǎng)價值很高[3]?；谶@種現(xiàn)狀，對飼料用脂肪酶研究進行一些探索性的工作，從而推動其在飼料工業(yè)中的應用，也是一件非常有意義的工作。

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Screening of a sour-resistant strain and properties of lipase

Wang Yan,Zhang Zhimin,Wang Bin,Wan Yi

More than 200 strains producing lipases were screened from a hundred and sixty-five oily soil in Xi'an suburbs and Qinba mountain area,Shaanxi Province,which included bacteria,moulds and yeasts;Ten sour-resistant strains were screened through glyceryl tributyrate plate,one of them that has a higher lipase activity was researched.It was identified as galactomyces geotrichum,by its morphological and 18S rDNA sequences.On the basis of above experiments,a Shaanxi characteristic library of strains producing lipases and the method for screening sour-resistant strains were established.The strain FL002 and its enzyme,which is both heat-resistant and sour-resistant,are expected to be used in the industry of forage.

galactomyces geotrichum；lipase;heat-resistant；sour-resistant；forage

Q556

A

1001-991X（2011）10-0029-05

王琰，陜西省微生物研究所，710043，陜西省西安市西影路76號。

張志敏、王斌、萬一（通訊作者），單位及通訊地址同第一作者。

2011-02-14

陜西省科學院青年基金項目支持[2009k-27]

（編輯：高 雁，snowyan78@163.com）