登革2型病毒與整合素β3相互作用機(jī)制的研究

明 穎，高 娜，張俊磊，陳 輝，王 娟，范東瀛，吳江漫，安 靜

登革病毒（dengue virus,DV）為黃病毒科單股正鏈RNA 病毒，僅含有一個(gè)開放讀碼框，編碼3 個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白（C,prM 和E）以及7 個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白（NS1～NS5）。依E 蛋白抗原性的不同，DV 分為4 個(gè)血清型（DV1～4），以埃及伊蚊和白紋伊蚊為傳播媒介，引起人類的登革熱（dengue fever,DF）、登革出血熱/登革休克綜合征（dengue hemorrhagic fever/dengue shock syndrome,DHF/DSS），后者癥狀較重，有明顯的出血傾向，病死率高，但發(fā)病機(jī)制尚不明確，目前多數(shù)學(xué)者認(rèn)為可能與血管內(nèi)皮細(xì)胞（vascular endothelial cell,VEC）功能改變或者結(jié)構(gòu)改變有關(guān)[1-2]。

整合素是廣泛分布于細(xì)胞表面的跨膜糖蛋白受體，由α 和β 亞單位組成。作為信號(hào)受體，不僅介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞之間、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間的相互作用，并在細(xì)胞的生長、移行、增殖和分化等諸多生理過程中亦發(fā)揮重要作用。已知VEC 表面分布著豐富的整合素β1 和β3。有研究發(fā)現(xiàn)，整合素β3 對(duì)維持毛細(xì)血管的完整性、調(diào)節(jié)血管通透性方面具有重要作用[3-4]。在前期研究中，我們發(fā)現(xiàn)DV2 進(jìn)入哺乳動(dòng)物株ECV304 細(xì)胞需要整合素β3 分子的參與[5-6]。但有研究表明，依據(jù)細(xì)胞類型的不同，介導(dǎo)DV 吸附和進(jìn)入宿主細(xì)胞的蛋白分子有所不同[7-9]。本實(shí)驗(yàn)旨在探討DV2 感染VEC 株EA.hy926過程中，整合素β3 的可能作用及其與之相互作用的病毒蛋白，在觀察DV2 感染后整合素β3 表達(dá)變化的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步將表達(dá)DV2 各個(gè)蛋白的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染EA.hy926 細(xì)胞，分析病毒蛋白與整合素β3表達(dá)及共存關(guān)系，期望為深入闡明DV 致病機(jī)制提供有價(jià)值參考資料。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 細(xì)胞株和病毒株 EA.hy926、C6/36 和Vero細(xì)胞由本教研室保存。DV2（Tr1751 株）分離自登革熱患者，由日本感染病研究所大谷明博士惠贈(zèng)。病毒經(jīng)C6/36 細(xì)胞增殖，-80 ℃凍存?zhèn)溆谩ero 細(xì)胞噬斑法檢測(cè)病毒滴度。

1.1.2 抗體 DV2 兔多克隆抗體為本實(shí)驗(yàn)室自制，鼠抗人整合素β3 單克隆抗體購自英國abcam 公司，異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate,FITC）標(biāo)記的羊抗兔IgG 及Cy3 標(biāo)記的羊抗鼠IgG 購自美國Sigma 公司。

1.1.3 質(zhì)粒 DV2 各病毒蛋白質(zhì)粒pRe-C、pRe-E、pRe-NS1-2a、pRe-NS2b、pRe-NS3、pRe-NS5 及空載體pReceiverM01 由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建和保存，pNS4a-HA、pNS4-HA 由Adolfo García-Sastre[10]惠贈(zèng)，HCV C 蛋白質(zhì)粒pHCV-C 由本室構(gòu)建和保存。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 增殖曲線測(cè)定 將EA.hy926 細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，傳代于六孔培養(yǎng)板，2×105/孔，37 ℃，5%CO2，孵育18～24 h 后，吸出培養(yǎng)上清液，磷酸緩沖液（phosphate buffer solution,PBS）潤洗1 次，進(jìn)而加入DV2［感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection,MOI）=1］感染，分別于感染后1、2、3、4、5、6 d 各取出200 μl 培養(yǎng)上清液，采用Vero 細(xì)胞噬斑法檢測(cè)病毒滴度，繪制增殖曲線。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.2.2 病毒感染實(shí)驗(yàn) 將EA.hy926 細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，以2×105/孔接種于內(nèi)置玻片的六孔培養(yǎng)板中，37 ℃，5% CO2，孵育18～24 h 后，吸出培養(yǎng)上清液，用PBS 潤洗1 次，進(jìn)而加入DV2（MOI=1）。模擬感染組（mock 組）則加入56 ℃滅活30 min 的DV2 液，同等條件置于37 ℃，5%CO2孵育，于24、48、72 h 將細(xì)胞爬片取出進(jìn)行免疫熒光雙染色。

1.2.3 病毒蛋白轉(zhuǎn)染EA.hy926 細(xì)胞 抽提質(zhì)粒pRe-C、pRe-E、pRe-NS1、pRe-NS2b、pRe-NS3、pRe-NS5、pNS4a-HA、pNS4b-HA DNA，分別轉(zhuǎn)染EA.hy926細(xì)胞，同時(shí)設(shè)pHCV-C、pReceiverM01 空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染EA.hy926 細(xì)胞作為對(duì)照。操作步驟參照Lipofectin Reagent 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染說明書，轉(zhuǎn)染后48 h，免疫熒光方法檢測(cè)整合素β3 的表達(dá)量變化及其與各蛋白的共存情況。

1.2.4 免疫熒光雙染色 將病毒感染或轉(zhuǎn)染后得到的細(xì)胞爬片以4%多聚甲醛固定20 min，0.2%Triron X-100 通透5 min，進(jìn)而用含1%的牛血清白蛋白PBS 進(jìn)行封閉20 min，加兔抗DV2 抗體（1∶100稀釋），4 ℃孵育過夜，PBS 洗3 次（5 min/次），加入羊抗兔IgG-FITC（1∶300 稀釋），室溫孵育1 h 后，PBS洗3 次（5 min/次），加入鼠抗人整合素β3 單克隆抗體（1∶100 稀釋），4 ℃孵育過夜，用PBS 洗3 次（5 min/次），加入羊抗鼠IgG-Cy3（1∶300 稀釋），室溫孵育1 h后，PBS 洗3 次（5 min/次），以熒光顯微鏡（Olympus BX61）及激光共聚焦顯微鏡（Leica TCS SP5）觀察β3 表達(dá)量的變化及與病毒蛋白的共存情況。

2 結(jié) 果

2.1 增殖曲線測(cè)定 DV2 感染EA.hy926 細(xì)胞后于不同的時(shí)相點(diǎn)收獲培養(yǎng)上清液，采用Vero 細(xì)胞進(jìn)行滴度測(cè)定，結(jié)果見圖1：在該細(xì)胞株中，DV2 最高滴度在感染后第5 天出現(xiàn)，滴度達(dá)到1.7×105pfu/ml，說明DV2 能夠在EA.hy926 細(xì)胞中進(jìn)行增殖，可以將該細(xì)胞株作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象用于后續(xù)試驗(yàn)。

圖1 DV2在EA.hy926細(xì)胞中的增殖曲線Figure1 Growth curve of DV2 in EA.hy926 cells

2.2 病毒感染實(shí)驗(yàn) 病毒感染后不同時(shí)相點(diǎn)采用間接免疫熒光檢測(cè)整合素β3 表達(dá)量的變化（圖2）。結(jié)果如圖所示：與mock 組相比較，病毒感染后可見紅色熒光染色較強(qiáng)的細(xì)胞，整合素β3 的表達(dá)明顯增強(qiáng)，熒光主要分布于細(xì)胞膜，并且隨著感染時(shí)間的延長，整合素的表達(dá)量增加，胞漿也可見特異性熒光。經(jīng)免疫熒光雙染色，激光共聚焦顯微鏡下觀察病毒抗原和整合素β3 的共存，發(fā)現(xiàn)病毒感染后整合素β3 的表達(dá)量增高，且病毒抗原與整合素β3 有明顯共存（圖3～5），24 h 共存主要分布在包膜，48～72 h胞漿內(nèi)也可見一定量的共存。

圖3 DV2 感染24 h 后病毒抗原與整合素β3 共存(Bar=10 μm)Figure3 Co-localization of virus antigen and β3 integrin after 24 hours of DV2 infection (Bar=10 μm)

圖4 DV2感染48 h后病毒抗原與整合素β3共存(Bar=10 μm)Figure4 Co-localization of virus antigen and β3 integrin after 48 hours of DV2 infection (Bar=10 μm)

圖5 DV2感染72 h后病毒抗原與整合素β3共存(Bar=10 μm)Figure5 Co-localization of virus antigen and β3 integrin after 72 hours of DV2 infection (Bar=10 μm)

2.3 轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)結(jié)果 將pRe-C、pRe-E、pRe-NS1-NS2a、pRe-NS2b、pRe-NS3、pRe-NS5、pNS4a-HA、pNS4b-HA、pHCV-C、pReceiverM01 分 別 轉(zhuǎn) 染 至EA.hy926 細(xì)胞后，間接免疫熒光檢測(cè)病毒蛋白與整合素β3 表達(dá)情況見圖6～7。結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染后48 h，pRe-E 蛋白的表達(dá)可誘導(dǎo)整合素β3 的表達(dá)，且E蛋白與整合素β3 的表達(dá)存在明顯共存。除E 蛋白外，其他9 種DV2 蛋白質(zhì)粒和pHCV-C 及空質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染對(duì)整合素β3 表達(dá)無明顯影響，也未見其與整合素β3 有明顯共存。

圖6 空載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染48 h 免疫熒光染色結(jié)果(Bar=10 μm)Figure6 EA.hy926 cells were double-stained for empty vector plasmid and β3 integrin after 48 hours of trans-fection (Bar=10 μm)

3 討 論

圖7 pRe-E 蛋白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后免疫熒光染色結(jié)果(Bar=10 μm)Figure7 EA.hy926 cells were double-stained for pRe-E and β3 integrin(Bar=10 μm)

DV 感染已成為熱帶和亞熱帶地區(qū)一個(gè)嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題，全世界每年有5 千萬～1 億人感染DV，特別是以與我國接壤的東南亞地區(qū)最為嚴(yán)重[11]。目前對(duì)DV 感染尚無有效的疫苗和治療措施。DHF/DSS 的主要病理生理特點(diǎn)是血漿滲漏，而病理學(xué)檢查未發(fā)現(xiàn)VEC 有明顯器質(zhì)性損害，提示VEC 功能障礙導(dǎo)致血管通透性增加可能是DHF/DSS 發(fā)生的主要原因。

VEC 表面整合素含量豐富，多種病毒受體研究結(jié)果提示，整合素分子可以作為病毒受體或共受體[12-13]，協(xié)助病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞，在病毒與宿主細(xì)胞相互作用的過程中發(fā)揮重要作用[13-14]。而DV 感染VEC 的受體目前尚不明確[15]，因此本研究選用血管VEC 株EA.hy926 細(xì)胞作為研究對(duì)象，探討整合素在病毒進(jìn)入VEC 的過程中所發(fā)揮的作用。

前期的實(shí)驗(yàn)中，我們研究了整合素β3 在DV2感染中的作用，提示整合素β3 有助于DV2 進(jìn)入宿主細(xì)胞[5-6]。本實(shí)驗(yàn)首先證明了EA.hy926 能夠支持DV的復(fù)制，增殖曲線顯示，最高滴度出現(xiàn)在感染后第5 天，且光鏡下感染組與對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)無明顯差別，因此EA.hy926 可以作為研究DV感染機(jī)制的細(xì)胞模型。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，DV 感染可使EA.hy926 細(xì)胞中整合素β3 的表達(dá)量增高，且隨感染時(shí)間的延長有漸增趨勢(shì)。在此基礎(chǔ)上，我們將編碼DV2 病毒蛋白的10 個(gè)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染EA.hy926 細(xì)胞，觀察不同病毒蛋白轉(zhuǎn)染后整合素β3 表達(dá)量的變化。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染E 蛋白可誘導(dǎo)整合素β3 的表達(dá)，E 蛋白與整合素β3 有明顯的共存，而其他病毒蛋白的表達(dá)對(duì)整合素β3 表達(dá)無明顯影響，也無明顯共存。提示E 蛋白有可能作為DV感染細(xì)胞的吸附蛋白，與整合素β3 相互作用，介導(dǎo)DV2 的進(jìn)入細(xì)胞。

整合素β3可以特異性識(shí)別配體的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（Arg-Gly-Asp,RGD）三肽序列，從而介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間的相互作用，發(fā)揮其粘附和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)兩大基本功能。研究發(fā)現(xiàn)，口蹄疫病毒、柯薩奇病毒以及腺病毒都通過RGD 依賴的方式與整合素分子結(jié)合進(jìn)入細(xì)胞，但是DV2 的相關(guān)區(qū)域不含有RGD 序列，表明DV2 與整合素的相互作用并不依賴RGD 序列[16]。近期的研究發(fā)現(xiàn)，DV E 蛋白Ⅲ區(qū)外側(cè)的FG 環(huán)被認(rèn)為是宿主細(xì)胞感染的關(guān)鍵分子，為哺乳動(dòng)物細(xì)胞感染DV2所必需[17]。然而也有研究表明，E 蛋白Ⅲ區(qū)與哺乳動(dòng)物細(xì)胞株的結(jié)合可能不依賴于FG 環(huán)[18]。因此，整合素β3 與E 蛋白是否通過上述位點(diǎn)結(jié)合，尚須進(jìn)一步研究證實(shí)。

綜上所述，本文從血管通透性增高的機(jī)制入手，研究DV 感染對(duì)VEC 功能的影響，將有助于闡明DHF/DSS 的成因，為DV 感染的防治提供理論依據(jù)。

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