王文艷,仝瑤瑤,張林琪,宋吉倫,李貴生,,劉萬卉

(1.煙臺(tái)大學(xué)藥學(xué)院,山東煙臺(tái) 264005;2.山東綠葉制藥天然藥物研究中心,山東煙臺(tái) 264005)

HPLC-MS/MS法鑒定落新婦苷在大鼠尿中的代謝產(chǎn)物

王文艷1,仝瑤瑤1,張林琪1,宋吉倫2,李貴生1,2,劉萬卉1

(1.煙臺(tái)大學(xué)藥學(xué)院,山東煙臺(tái) 264005;2.山東綠葉制藥天然藥物研究中心,山東煙臺(tái) 264005)

為鑒定大鼠給藥落新婦苷后尿中的主要代謝產(chǎn)物,收集其尿樣,用聚酰胺固相萃取小柱處理后進(jìn)樣,采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)法分析。電噴霧離子源在負(fù)離子模式下進(jìn)行掃描,借助碰撞誘導(dǎo)解離方式進(jìn)行落新婦苷在大鼠體內(nèi)主要代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)確證。共鑒定出6個(gè)落新婦苷在大鼠尿中的代謝產(chǎn)物,分別為落新婦苷異構(gòu)體(M1)、3′-O-甲基化落新婦苷(M2)、3′-O-甲基化落新婦苷異構(gòu)體(M3)、槲皮素-鼠李糖苷(M4)、葡萄糖醛酸化落新婦苷 (M5)、3′-O-甲基化落新婦苷-葡萄糖醛酸化物(M6)。該方法對(duì)落新婦苷在大鼠體內(nèi)的代謝進(jìn)行了初步研究,并報(bào)道了落新婦苷在大鼠尿中的另外4個(gè)代謝產(chǎn)物M1、M3、M4、M6。

落新婦苷;代謝產(chǎn)物;高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS);聚酰胺固相萃取小柱

落新婦苷(3-O-α-l-鼠李糖-5,7,3′,4′-4 羥基二氫黃酮醇)為中藥材土茯苓的提取物[1-2]。研究發(fā)現(xiàn),落新婦苷在體內(nèi)外有許多有益的藥理藥效作用,如抗菌活性[3]、免疫抑制活性[4]、抑制肝癌細(xì)胞系的擴(kuò)增[5]。另外,落新婦苷有類似于刀豆蛋白A的抗炎作用,但沒有副作用[6]。有研究報(bào)道了落新婦苷單劑量靜注給藥或灌胃給藥兔子后的藥動(dòng)學(xué)特性[7]。落新婦苷灌胃給藥后迅速被吸收,生物利用度低于10%。有學(xué)者以99 mg/kg劑量灌胃給藥大鼠后,在鼠尿中鑒定出落新婦苷的代謝產(chǎn)物為 3′-O-甲基-落新婦苷[8]。為了更全面的了解落新婦苷的體內(nèi)代謝情況,我們進(jìn)行了大鼠靜注給藥落新婦苷(10 mg/kg)后的代謝途徑研究。鼠尿樣經(jīng)自制的聚酰胺固相萃取小柱處理后,采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)法進(jìn)行檢測(cè),通過色譜及質(zhì)譜數(shù)據(jù)推測(cè)代謝物的結(jié)構(gòu)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與裝置

Agilent 1100 HPLC:美國安捷倫公司產(chǎn)品,配有在線脫氣機(jī)、四元梯度泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱和VWD檢測(cè)器;TSQ Quantum Access三重四極桿質(zhì)譜儀:美國 ThermoFisher公司產(chǎn)品,配有電噴霧離子源及Xcalibur1.4數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)。

1.2 主要材料與試劑

落新婦苷(純度＞98%):由山東綠葉制藥天然藥物研究中心提供;甲醇(色譜純):德國Merck公司產(chǎn)品;試驗(yàn)用水為去離子雙蒸水;聚酰胺(粒徑30～50μm):購自北京百靈威化學(xué)技術(shù)有限公司。

1.3 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

5只(235±11)g雄性 SD大鼠:由山東綠葉制藥有限公司實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。動(dòng)物飼養(yǎng)在代謝籠中,水和食物可以自由獲得。每只鼠尾靜脈注射給藥 10 mg/kg落新婦苷,給藥前(-12～0 h)收集空白尿樣,給藥后(0～12 h)收集尿樣,收集到尿樣后立即儲(chǔ)存于-20℃冰箱中 ,待測(cè)。

1.4 實(shí)驗(yàn)條件

1.4.1 色譜條件 Supelco Discovery C 18色譜柱(150 mm×2.1 mm×5μm),柱溫30 ℃。以90%甲醇作為A相,5%甲醇作為B相,按如下設(shè)置進(jìn)行梯度洗脫:0 min,100%B;6 min,90%B;12 min,60%B,保持 2 min;20 min,5%B,保持 3 min;24 min,100%B,保持7 min。紫外檢測(cè)波長設(shè)置為290 nm。

1.4.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源負(fù)離子檢測(cè)模式,噴霧電壓3 500 V,鞘氣壓力2.41×105Pa;輔氣壓力3.45×104Pa,毛細(xì)管溫度350℃,碰撞誘導(dǎo)解離電壓23 V,氬氣壓力0.2 Pa。

1.5 樣品處理

尿樣在冰水浴中融化后,8 000 r·min-1離心10 min,聚酰胺固相萃取小柱(200 mg)依次用4 mL甲醇活化和4 mL水平衡,然后將1 mL尿樣上樣到小柱上,再用2 mL水和4 mL甲醇洗脫小柱,收集甲醇洗脫相,在40℃用氮?dú)饬鞔蹈?。殘留物?0%甲醇水復(fù)溶后,10μL進(jìn)樣,HPLC-MS/MS分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 HPLC-MS/MS鑒定落新婦苷的代謝產(chǎn)物

為了消除內(nèi)源性物質(zhì)的干擾,鼠尿樣用自制的聚酰胺固相萃取小柱處理,聚酰胺基質(zhì)處理含有羥基或羧基基團(tuán)的化合物。與采用0.45μm濾膜過濾或乙腈沉淀蛋白預(yù)處理的尿樣方法比較,采用聚酰胺固相萃取小柱處理尿樣后,明顯減少了基質(zhì)干擾,并且有利于減少樣品對(duì)質(zhì)譜儀器的污染。高靈敏度的 ESI電離源結(jié)合串聯(lián)四極質(zhì)譜為推斷落新婦苷代謝物的結(jié)構(gòu)特性提供了信息?？瞻啄驑蛹奥湫聥D苷尿樣的典型HPLC-UV色譜圖和 TIC(總離子流)圖示于圖1。與空白尿樣比較,靜注給藥落新婦苷后,在鼠尿樣中可發(fā)現(xiàn)落新婦苷(M0)及其6個(gè)代謝產(chǎn)物M1～M6。

圖1 尿樣經(jīng)SPE預(yù)處理后的 HPLC-UV和TIC圖a.空白鼠尿;b.添加落新婦苷標(biāo)準(zhǔn)品的空白鼠尿;c.靜注給藥落新婦苷后的鼠尿樣Fig.1 HPLC-UVand TIC chromatograms of SPE extract a.blank rat urine;b.blank rat urine spiked with an astilbin standard;c.urine sample after intravenous administration of astilbin

2.2 落新婦苷M0及其代謝產(chǎn)物M1

負(fù)離子電噴霧質(zhì)模式下,掃描落新婦苷的準(zhǔn)分子離子峰為[M-H]-m/z449,色譜保留時(shí)間為18.4 min,經(jīng)碰撞誘導(dǎo)解離(CID),其產(chǎn)生的碎片離子為m/z303、285、179及151,示于圖2。m/z449丟失鼠李糖(Rha,146,C6H10O4)產(chǎn)生碎片離子m/z303,其進(jìn)一步碎裂產(chǎn)生碎片離子m/z285和m/z179,分別丟失了 18 u(H2O)和124 u(C6H4O3)。m/z179進(jìn)一步碎裂產(chǎn)生m/z151,丟失28 u(CO)。代謝物M1的色譜保留時(shí)間為19.5 min,其裂解過程及產(chǎn)生的碎片與落新婦苷一致,所以推斷M1為落新婦苷的同分異構(gòu)體。落新婦苷及其代謝產(chǎn)物M1的二級(jí)質(zhì)譜裂解途徑示于圖3。有研究報(bào)道,在土茯苓提取物中,落新婦苷還有3個(gè)同分異構(gòu)體,分別為新落新婦苷、異落新婦苷、新異落新婦苷[9-10]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),落新婦苷在體內(nèi)可以轉(zhuǎn)化為它的同分異構(gòu)體。

2.3 落新婦苷代謝產(chǎn)物M2和M3

落新婦苷代謝產(chǎn)物M2、M3的色譜保留時(shí)間分別為20.2 min和 20.9 min,它們的準(zhǔn)分子離子峰為[M-H]-m/z463,比落新婦苷[MH]-的m/z高14 u,經(jīng)碰撞誘導(dǎo)解離反應(yīng)產(chǎn)生一系列的碎片離子,分別為m/z317、299、289、179和151,示于圖4。m/z463丟失 Rha產(chǎn)生碎片離子m/z317,其進(jìn)一步碎裂產(chǎn)生m/z299、289和 179碎片離子,它們分別丟失 18 u(H2O),28 u(CO)和138 u(C2H2O)。m/z179丟失28 u(CO)產(chǎn)生碎片離子m/z151。結(jié)果表明,M2和M3分別是落新婦苷及其同分異構(gòu)體的甲基化產(chǎn)物。有文獻(xiàn)[8]鑒定,落新婦苷灌胃給藥大鼠后,鼠尿中的甲基化代謝產(chǎn)物為3′-O-甲基-落新婦苷。落新婦苷及其同分異構(gòu)體的甲基化代謝物的質(zhì)譜裂解途徑示于圖5。

圖2 落新婦苷及其異構(gòu)體(M0,M1,m/z449)的 HPLC-MS/MS圖a.掃描質(zhì)譜圖;b.SIM色譜圖;c.CID碎片離子Fig.2 HPLC-MS/MS spectrum of astilbin and its stereoisomer(M0 and M1,m/z449)a.mass scan spectra;b.selected ion monitoring(SIM)chromatogram;c.CID product ion spectra

圖3 落新婦苷m/z449離子的可能裂解機(jī)理Fig.3 Proposed decomposition process ofm/z449[M-H]-ion of astilbin

2.4 落新婦苷代謝產(chǎn)物M4

代謝產(chǎn)物M4的準(zhǔn)分子離子峰為[M-H]-m/z447,色譜保留時(shí)間為17.4 min。經(jīng)碰撞誘導(dǎo)解離后產(chǎn)生的碎片離子m/z301,它是m/z447丟失Rha產(chǎn)生的,示于圖6。m/z447比落新婦苷[M-H]-的m/z少2 u,即m/z449丟失2 u(H2)。因此推斷落新婦苷在體內(nèi)進(jìn)行了脫氫反應(yīng),這樣二氫黃酮苷氧化為黃酮苷,推斷M4為槲皮素-鼠李糖苷,并且有文獻(xiàn)[11]報(bào)道槲皮素-鼠李糖苷的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)離子對(duì)為m/z447/301,這與圖 6c中m/z447的 CID圖譜相符。

2.5 落新婦苷代謝產(chǎn)物M5

代謝產(chǎn)物M5的液相色譜保留時(shí)間為12.6 min,準(zhǔn)分子離子峰為[M-H]-m/z625,比落新婦苷[M-H]-的m/z高176 u,示于圖7。經(jīng)碰撞誘導(dǎo)解離M5產(chǎn)生一系列的碎片離子m/z449、303和285,相應(yīng)為落新婦苷[M-H]-及其碎片的質(zhì)譜峰,而且葡萄糖醛酸基團(tuán)的特征峰為m/z176,因此代謝物M5鑒定為葡萄糖醛酸化落新婦苷。文獻(xiàn)[8]報(bào)道大鼠灌胃給藥落新婦苷后,在鼠膽汁中發(fā)現(xiàn)了葡萄糖醛酸化落新婦苷,但在血漿和尿樣中未發(fā)現(xiàn)該代謝物。

圖6 槲皮素-鼠李糖苷(M4,m/z447)的 HPLC-MS/MS圖a.掃描質(zhì)譜圖;b.SIM色譜圖;c.CID碎片離子Fig.6 HPLC-MS/MS spectrum of quercetin rhamnoside(M4,m/z447)a.mass scan spectra;b.selected ion monitoring(SIM)chromatogram;c.CID product ion spectra

圖7 葡萄糖醛酸化落新婦苷(M5,m/z625)的 HPLC-MS/MS圖a.掃描質(zhì)譜圖;b.SIM色譜圖;c.CID碎片離子Fig.7 HPLC-MS/MS spectrum of astilbin glucuronide(M5,m/z625)obtained using negative ion electrospray and CID a.mass scan spectra;b.selected ion monitoring(SIM)chromatogram;c.CID product ion spectra

2.6 落新婦苷代謝產(chǎn)物M6

代謝產(chǎn)物M6的液相色譜保留時(shí)間為13.5 min,其準(zhǔn)分子離子峰為 [M-H]-m/z639,比甲基化落新婦苷[M-H]-高176 u。經(jīng)碰撞誘導(dǎo)解離后,M6產(chǎn)生一系列碎片離子m/z463、317、299和289,它們?yōu)榧谆湫聥D苷及其碎片的離子峰,示于圖8。因此,推斷代謝物 M6為甲基化落新婦苷的葡萄糖醛酸化物,即3′-O-甲基-落新婦苷-葡萄糖醛酸化物。

圖8 甲基化落新婦苷的葡萄糖醛酸化物(M5,m/z639)的 HPLC-MS/MS圖a.掃描質(zhì)譜圖;b.SIM色譜圖;c.CID碎片離子Fig.8 HPLC-MS/MS spectrum of methylastilbin glucuronide(M6,m/z639)a.mass scan spectra;b.selected ion monitoring(SIM)chromatogram;c.CID product ion spectra

3 結(jié)論

落新婦苷靜脈注射給藥大鼠后,鼠尿樣經(jīng)聚酰胺固相萃取小柱處理后,采用 HPLC-MS/MS法鑒定的落新婦苷代謝產(chǎn)物主要為落新婦苷異構(gòu)體 (M1)、3′-O-甲基-落新婦苷 (M2)、3′-O-甲基-落新婦苷異構(gòu)體(M3)、槲皮素-鼠李糖苷(M4)、葡萄糖醛酸化落新婦苷(M5)和 3′-O-甲基-落新婦苷-葡萄糖醛酸化物(M6)。落新婦苷在大鼠體內(nèi)的代謝途徑推斷示于圖9。M2和M5有文獻(xiàn)[8]報(bào)道,其余4種代謝產(chǎn)物 (M1、M3、M4、M6)未在鼠尿中落新婦苷代謝物的報(bào)道中發(fā)現(xiàn),表明落新婦苷在鼠體內(nèi)除發(fā)生了甲基化和葡萄醛酸化代謝反應(yīng)外,還可進(jìn)行異構(gòu)化和脫氫化代謝反應(yīng)。推測(cè)落新婦苷的代謝途徑有助于理解落新婦苷的作用機(jī)制,并為以后的臨床試驗(yàn)提供有益信息。

圖9 落新婦苷在鼠體內(nèi)的可能代謝途徑Fig.9 Proposed metabolic pathw ay of astilbin in vivo in the rat

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Identification of the Major Metabolites of Astilbin in Rat Urine by HPLC-MS/MS

WANG Wen-yan1,TONG Yao-yao1,ZHANG Lin-qi1,SONGJi-lun2,LI Gui-sheng1,2,LIU Wan-hui1
(1.School ofPharmacy,Yantai University,Yantai264005,China;2.Research Center of N atural Medicine of Shandong L uye Pharmaceutical,Yantai264005,China)

To identify the major metabolites of astilbin in rats,urine samples were collected after intragastric administration of astilbin.The urine samples were pretreated by solidphase extraction using polyamide cartridges,and then were analyzed by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(HPLC-MS/MS).Electrospray ionization source operated in negative mode for scan and collision induced dissociation were used to elucidate the structures of the major metabolites of astilbin.The data indicated that the main urine metabolites of astilbin are stereoisomers of astilbin(M1),3′-O-methylastilbin(M2),a stereoisomer of 3′-O-methylastilbin(M3),quercetin rhamnoside(M4),astilbin glucuronide(M5),3′-O-methylastilbin glucuronide(M6).Metabolites of M1,M3,M4 and M6 are reported from rat urine.

book=37,ebook=37

astilbin;metabolite;high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(HPLC-MS/MS);polyamide solid-phase extraction

O 657.63

A

1004-2997(2011)01-0036-07

2010-01-27;

2010-05-31

王文艷(1976～),女(蒙古族),內(nèi)蒙古赤峰人,博士,講師,從事藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究。

E-mail:wangwenyan345@yahoo.com.cn

劉萬卉(1964～),男(土家族),湖南人,博士,教授,從事藥物分析研究。E-mail:PAL05@ytu.edu.cn