NR1磷酸化在神經(jīng)生長因子加劇大鼠骨癌痛中的作用

姚鵬，丁遠遠，馬佳明，蔣晶晶，張錦，孟凌新

（中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院1.疼痛科；2.麻醉科，沈陽 110004）

NR1磷酸化在神經(jīng)生長因子加劇大鼠骨癌痛中的作用

姚鵬1，丁遠遠1，馬佳明1，蔣晶晶2，張錦2，孟凌新1

（中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院1.疼痛科；2.麻醉科，沈陽 110004）

目的探討骨癌痛大鼠背根神經(jīng)節(jié)（DRG）神經(jīng)生長因子（NGF）表達及NR1磷酸化情況，并觀察鞘內注射神經(jīng)生長因子抗體（anti-NGF）對NR1磷酸化及骨癌痛大鼠疼痛行為的影響。方法 檢測骨癌痛大鼠DRG NGF的表達及NR1磷酸化：雌性SD大鼠隨機分成假手術（sham）組及cancer組，每組10只，分別在左脛骨注射PBS液或walker256瘤細胞，21d取左側L4-5DRG。檢測anti-NGF對NR1磷酸化及大鼠疼痛行為的影響：骨癌痛大鼠鞘內置管，隨機分成生理鹽水（NS）組及anti-NGF組，于接種瘤細胞16d開始分別鞘內注射生理鹽水或anti-NGF。于接種瘤細胞前、接種后13、18及21d進行疼痛行為測試，接種21d取大鼠左側L4-5DRG，Western blot方法檢測NR1磷酸化。結果 與sham組比較，cancer組大鼠DRG NGF表達顯著上調，NR1磷酸化水平增加（P<0.01）。鞘內注射anti-NGF后，與NS組比較，機械痛閾降低和熱輻射潛伏期延長。NS組NR1磷酸化水平高于anti-NGF組（P<0.05）。結論anti-NGF減弱骨癌痛、抑制NR1磷酸化，提示NGF通過NR1磷酸化加劇大鼠骨癌痛。

神經(jīng)生長因子；N-甲基-D-天冬氨酸受體；磷酸化；骨癌痛

腫瘤患者發(fā)病率呈逐年上升的趨勢，Thun等［1］2010年的統(tǒng)計結果顯示：腫瘤已成為危及人類生命的主要原因之一。據(jù)統(tǒng)計，70%～90%的腫瘤患者發(fā)生癌痛，乳腺癌、前列腺癌及肺癌等腫瘤容易發(fā)生骨轉移而引起骨癌痛，我們前期的研究［2］顯示，大鼠脛骨注射walker256瘤細胞誘發(fā)的骨腫瘤模型中，神經(jīng)生長因子（nerve growth factor，NGF）加劇骨癌痛，大鼠鞘內注射抗神經(jīng)生長因子抗體（nerve growth factor polyclonal antibodies，anti-NGF） 可明顯抑制骨腫瘤引起的痛敏。

NGF 在炎性疼痛［3］和神經(jīng)病理性疼痛［4］中發(fā)揮重要作用。電生理研究發(fā)現(xiàn)：傷害性感受器的興奮性與NGF的含量密切相關。NGF不僅可直接活化感覺神經(jīng)元，還可調控一些神經(jīng)遞質、受體、通道的活性。N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartate，NMDA）受體在炎性痛和神經(jīng)病理性疼痛中發(fā)揮重要作用［5］，Traynelis等［6］也總結了 NGF 對 NMDA受體的調制作用，但是在骨癌痛中是否存在這樣的調制作用尚不清楚。

我們推測NGF可以上調脊髓背根神經(jīng)節(jié)（dorsal root ganglion，DRG）NMDA 受體 NR1亞單位，因此本研究探討骨癌痛大鼠背根神經(jīng)節(jié)NGF表達及NR1磷酸化情況，并觀察鞘內注射anti-NGF對NR1磷酸化及骨癌痛大鼠疼痛行為的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

雌性SD大鼠，體質量200～220g，由中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院動物室提供。動物飼養(yǎng)于鋪墊鋸末塑料盒內，每籠5只飼養(yǎng)，室內溫度（22±0.5）℃，濕度40%～60%，自然照明，自由攝食、飲水。實驗獲得中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院倫理委員會的批準。

1.2 實驗分組及方法

1.2.1 骨癌痛大鼠DRG NGF的表達及NR1磷酸化：雌性SD大鼠隨機分成假手術（sham）組及cancer組，分別在左脛骨注射PBS液或walker256瘤細胞，方法參照文獻［2］的實驗方法，每組10只，21d取左側L4-5DRG。

1.2.2 Anti-NGF對NR1磷酸化及大鼠疼痛行為學的影響：骨癌痛大鼠接種瘤細胞13d鞘內置管，隨機分成生理鹽水（NS）組及anti-NGF組，每組10只，于接種瘤細胞16d開始分別鞘內注射生理鹽水（10μl/只）或 anti-NGF（10μl/只，用生理鹽水稀釋為 1μg/μl），每日 2次，連續(xù) 5d。于接種瘤細胞前、接種后13、18及21d觀察熱輻射縮爪潛伏期（paw withdrawal latency，PWL）及機械性縮爪閾值（paw withdrawal threshold，PWT），接種21d測試后取大鼠左側L4-5DRG，Western blot方法檢測NR1磷酸化。

1.3 主要儀器和試劑

walker 256細胞（中國醫(yī)學科學院腫瘤研究所提供），von Frey細絲（美國 Stoeling公司），BME-410A熱輻射刺激儀（中國醫(yī)學科學院生物工程研究所），銀汞混合器（北京四泰新技術開發(fā)公司），兔抗NGF，anti-NGF及P-NR1抗血清（Santa Cruz公司）。

1.4 瘤細胞提取

walker 256細胞為來源于大鼠乳腺癌的腹水瘤細胞，保存在中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院中心實驗室液氮罐中，用快融方法復蘇并接種于大鼠腹腔傳代，抽取腹水、離心、計數(shù)。

1.5 大鼠脛骨癌痛模型的建立及鞘內置管

采用以往的方法［2］建立大鼠脛骨骨癌痛模型。水合氯醛麻醉（10%，3.5×10-3ml/g）大鼠脛骨骨髓腔緩慢注入10μl含walker256的PBS細胞懸液，共含癌細胞1×105個，注射時間為2min，注射完畢后迅速用銀汞合劑封住針孔，分別用75%乙醇和無菌生理鹽水沖洗切口，皮膚分層縫合。sham組大鼠左側脛骨上段注入等體積的PBS液，其余操作同cancer組。鞘內置管采用PE-10導管，L2-3椎間隙置管，導管尖端置于接近L5DRG位置，取無感覺和運動障礙的動物作為研究對象，實驗結束時確認導管尖端的正確位置［7］。

1.6 PWL及PWT測定

測定熱輻射刺激引起的縮爪潛伏期，將大鼠置入觀察籠內，待其安靜后將光輻射焦點對準足趾底中部，打開光源，從照射開始至大鼠抬腿或逃走的潛伏期作為熱痛閾值，測定3次，時間間隔10min，取其平均值。為防止燙傷，將PWL的上限值定為20s；機械測試時大鼠在刺激時間內或在移開von Frey細絲時立即出現(xiàn)快速的縮足反應，記為陽性反應，直到找到1個纖維細絲，用其連續(xù)測試5次中有3次陽性反應，認定其為閾值（g），最高閾值設為26g，前后兩次不同刺激間隔10s。

1.7 Western blot檢測

大鼠接種瘤細胞后21d，水合氯醛麻醉，斷頭處死，取左側L4-5DRG。應用凱基生物試劑盒（KGP350）提取胞膜蛋白，采用BCA法進行蛋白定量。按每孔40μg總蛋白煮沸變性后上樣，SDSPAGE電泳（成層膠濃度5%，分離膠濃度10%）分離蛋白，4℃，200mA，2h濕轉印至PVDF膜上。PVDF膜用5%脫脂奶粉室溫封閉1h，分別與封閉液稀釋的 P-NR1抗血清（1∶1000）或 NGF抗體（1∶1000），4℃孵育過夜。然后加入稀釋的辣根過氧化物酶標記的二抗山羊抗兔IgG（1∶2000）室溫雜交2h，最后采用ECL化學發(fā)光法檢測蛋白條帶信號。每個標本重復實驗3次，以β-actin為內參進行相對定量分析。

1.8 統(tǒng)計學分析

選用SPSS 13.0進行統(tǒng)計處理，計量資料以x±s表示，組間比較采用成組t檢驗或單因素方差分析，繼以LSD或SNK處理。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 骨癌痛誘導NGF表達上調及NR1磷酸化

NGF在cancer組大鼠DRG表達顯著上調，與sham組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）；cancer組大鼠DRG NR1磷酸化水平也顯著高于sham組。提示骨癌痛誘導NGF表達及NR1磷酸化水平上調。見圖 1，2。

2.2 anti-NGF減弱機械和熱痛敏并降低NR1磷酸化水平

大鼠脛骨接種瘤細胞前（基礎值）PWL和PWT無統(tǒng)計學差異，接種13d，PWL縮短，PWT降低，大鼠出現(xiàn)機械和熱痛敏。鞘內注射anti-NGF后，與NS組比較，PWL 延長，PWT 增高，見表 1，2。

表1骨癌痛大鼠P WL變化（±s，s）T a b.1C h a n g e s o f P WL i n b o n e c a n c e r r a t s（±s，s）Post-inoculation day 13 day 18 day 21NS 13.2±1.4 8.5±1.2 6.8±0.4 4.0±0.5Anti-NGF 13.1±1.5 8.7±1.3 9.1±0.61） 9.6±1.11）1）P<0.05vs NS group；PWL，paw withdrawal latency.Group Baseline

表2骨癌痛大鼠P WT變化（±s，g）T a b.2C h a n g e s o f P WTi n b o n e c a n c e r r a t s（±s，g）Post-inoculation day 13 day 18 day 21NS 15.9±2.4 5.5±1.1 3.9±0.6 3.7±0.6Anti-NGF 16.1±2.1 5.7±1.2 9.5±1.61） 9.8±1.21）1）P<0.05vs NS group；PWT，paw withdrawal threshold.Group Baseline

鞘內注射NS或anti-NGF后，anti-NGF組大鼠DRG NR1磷酸化水平明顯低于NS組，結果顯示骨癌痛大鼠DRG NGF表達上調促進了NR1磷酸化水平，見圖3。

3 討論

骨癌痛是一種機制極為復雜的慢性疼痛，涉及神經(jīng)損傷所致病理性痛、瘤細胞的壓迫、缺血、細胞因子及其他炎性介質釋放所致的炎性痛等，共同構成骨癌痛的慢性疼痛綜合征。這種復雜的、不斷演變的疼痛類型導致骨癌痛很難控制。本研究中NGF在骨癌痛大鼠DRG表達顯著上調。以往的一些研究顯示NGF在炎性疼痛［3］和神經(jīng)病理性疼痛［4］中發(fā)揮重要作用，NGF可以介導炎癥和免疫反應，產(chǎn)生感覺超敏，當組織受到傷害性刺激時，NGF可以激活神經(jīng)元終末的TrkA、P75受體，從而激活細胞內的信號級聯(lián)反應，調制、活化不同的離子通道，引起中樞敏化，產(chǎn)生痛覺超敏或痛覺異常。一些基于骨腫瘤的研究顯示，腫瘤細胞在骨髓腔內不斷生長，腫瘤細胞本身會釋放NGF；腫瘤浸潤組織的白細胞增多，占整個腫瘤組織的80%，活化的白細胞會合成并釋放大量高濃度的生長因子［8］。本研究結果提示DRG也存在NGF的高表達。

NMDA受體是一種配體門控型Ca2＋通道，在傷害性疼痛信號傳導、整合過程中發(fā)揮重要作用，而NR1是NMDA受體的功能性亞單位，代表NMDA受體的活性狀態(tài)。有研究顯示［9］，大鼠DRG神經(jīng)元中約90%顯示NMDA受體樣免疫染色陽性，提示外周NMDA受體在疼痛產(chǎn)生過程中可能起重要作用。本研究中骨癌痛大鼠DRG NR1磷酸化水平增高，顯示磷酸化NR1參與骨癌痛的產(chǎn)生和維持過程，這與以往在炎性痛和神經(jīng)病理性痛模型的研究結果一致［5］。

本研究同時顯示鞘內注射anti-NGF減弱骨癌痛的機械和熱痛敏，與Sevcik等［10］腹腔內注射anti-NGF緩解小鼠骨肉瘤疼痛的結果一致。疼痛行為學結果提示NGF參與大鼠骨癌痛的傷害性信號由外周向中樞的傳遞過程，加劇骨腫瘤誘發(fā)的疼痛。另外，anti-NGF顯著抑制骨腫瘤誘導的NR1磷酸化水平。這一結果提示NGF表達上調增加了NR1的磷酸化，從而促進骨腫瘤誘發(fā)的疼痛反應，而anti-NGF緩解骨癌痛可能與抑制了NR1的磷酸化有關。然而，由于骨癌痛的復雜性及NGF的多效性，阻斷NGF通路，其產(chǎn)生的反應也是復雜的［11］，NGF加劇骨癌痛，但并不能排除有其他信號傳導通路的參與。Zou等［12］研究顯示PKC抑制劑有明顯的抗傷害感受作用，且其作用與抑制NR1的磷酸化有關，提示NR1磷酸化受PKC的調制。以往研究顯示［13］骨髓發(fā)出的感覺傳入神經(jīng)纖維86%是降鈣素基因相關肽（calcitonin gene-related peptide，CGRP）神經(jīng)纖維，而幾乎所有表達CGRP的纖維都表達TrkA。因此，骨腫瘤時局部釋放大量的NGF與TrkA結合，激活肽能傷害感受器，促進CGRP的釋放，通過PKC途徑調制NR1亞單位磷酸化。另外，NMDA受體同時也存在于脊髓背角及上位中樞，傳遞、整合傷害性信息，我們將在今后的研究中進一步探討NGF、NR1亞單位磷酸化在骨癌痛敏化過程中的中樞作用。

綜上，anti-NGF減弱骨癌痛、抑制NR1磷酸化，提示NGF通過NR1磷酸化加劇大鼠骨癌痛。

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（編輯武玉欣，英文編輯王又冬）

Roles of NMDA Receptor NRl Subunit Phosphorylation on Nerve Growth Factor-facilitated Bone Cancer Pain in Rats

YAO Peng1，DING Yuan-yuan1，MA Jia-ming1，JIANG Jing-jing2，ZHANG Jin2，MENG Ling-xin1
（1.Department of Pain，Shengjing Hospital，China Medical University，Shenyang 110004，China；2.Department of Anaesthesiology，Shengjing Hospital，China Medical University，Shenyang 110004，China）

ObjectiveTo evaluate the expression of nerve growth factor（NGF）and NMDA receptor NR1subunit phosphorylation and investigate the effects of anti-NGF on dorsal root ganglion（DRG）NR1phosphorylation and pain in the rats with bone cancer pain.MethodsTwenty rats were randomly divided into sham and cancer group（n=10per group）by inoculating PBS or walker256cancer cell solution into the left tibia.On day 21，the left lumbar 4-5DRG were removed for detecting the expression of NGF and phosphorylated NR1with Western blot.Cancer rats，in which the intrathecal catheter were surgically implanted，were randomly assigned to NS and anti-NGF group （n=10per group）.Intrathecal injection of saline or anti-NGF was given from day 16to 21after inoculation.Mechanical and thermal hyperalgesia was assessed before inoculation （baseline），on day 13，18and 21after inoculation.After the behavioral test on day 21，the left lumbar 4-5DRG were removed to measure phosphorylated NR1with Western blot.ResultsThe expression of NGF and the levels of phosphorylated NR1were significantly up-regulated in the DRG of the cancer group rats compared with those of sham group.Intrathecal injection of anti-NGF attenuated the mechanical and thermal hyperalgesia compared with the rats of group NS，a reduced tendency in paw withdrawal latency（PWL）and a decreased paw withdrawal threshold（PWT）were observed in anti-NGF group rats.Phosphorylated NR1levels were significantly higher in NS group rats than anti-NGF group rats，which indicated that anti-NGF inhibited DRG NR1phosphorylation during bone cancer pain.ConclusionAnti-NGF might attenuate bone cancer pain and inhibit NR1phosphorylation，which indicated that NGF could enhance NR1phosphorylation to facilitate bone cancer pain.

nerve growth factor；N-methyl-D-aspartate receptor；phosphorylation；bone cancer pain

R738

A

0258-4646（2011）02-0117-05

doiCNKI：21-1227/R.20110212.0950.005

遼寧省自然科學基金資助項目（20082111）

姚鵬（1971-），男，講師，博士.

張錦，E-mail：jinzhang_cmu2h@yahoo.com.cn

2010-11-23