孫 斌 劉洪臣

水凝膠是一種親水性的多聚物的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)物質(zhì)，它能夠吸收和保留相當(dāng)一部分水份并使它們維持一定的形狀[1]，由于其親水的特性，被廣泛的應(yīng)用于生物醫(yī)藥領(lǐng)域[2]。其最大的優(yōu)點(diǎn)在于它們可以在液態(tài)下復(fù)合細(xì)胞、治療性的藥物、生長(zhǎng)因子等，以內(nèi)窺鏡或者注射器等微創(chuàng)的方式將其植入體內(nèi)并且在原位形成凝膠。通常，它們以化學(xué)交聯(lián)或者物理交聯(lián)的方式使水凝膠在原位完成液態(tài)至固態(tài)(凝膠)的相轉(zhuǎn)變過(guò)程?；瘜W(xué)交聯(lián)是指通過(guò)光聚合反應(yīng)(photopolymerization)[3]，二硫化物粘合(disulfide bond)，或者由硫氫基、丙烯酸酯、砜基[4]等交聯(lián)劑引發(fā)化學(xué)反應(yīng)而引發(fā)凝膠化。物理交聯(lián)是指通過(guò)一些環(huán)境因素的改變，如pH值、溫度、或者二者共同的刺激引發(fā)凝膠化。由于物理交聯(lián)的水凝膠能在體外以很好的流動(dòng)性接種細(xì)胞等物質(zhì)，在體內(nèi)接受物理刺激迅速的轉(zhuǎn)變?yōu)楣虘B(tài)凝膠，而且避免了光的輻照，化學(xué)交聯(lián)劑的污染，以及在化學(xué)交聯(lián)可能引發(fā)的體積變化和產(chǎn)熱等缺點(diǎn)，所以近些年來(lái)，此類依靠溫度、pH刺激引發(fā)凝膠化的水凝膠系統(tǒng)尤為得到人們的廣泛關(guān)注[5]。

2000年，chenite等[6]利用酸性的殼聚糖溶液與β-甘油磷酸鈉(GP)制備了一種具有中性pH值，依靠溫度改變引發(fā)凝膠化的殼聚糖/GP基水凝膠系統(tǒng)。殼聚糖是一種可生物降解，具有天然抗菌性以及良好生物形容性的天然多聚體[7,8]。由于殼聚糖良好的生物性能，這種殼聚糖/GP基水凝膠系統(tǒng)成為人們研究的熱點(diǎn)。下面，我們就它的一些凝膠機(jī)制，以及在藥物緩釋及組織工程研究應(yīng)用等方面作一個(gè)綜述。

1.殼聚糖/GP基水凝膠的凝膠特性

殼聚糖是一種天然的陽(yáng)離子多糖,當(dāng)pH小于6.2時(shí)溶解于醋酸等酸性溶液中，當(dāng)高于這個(gè)數(shù)值則出現(xiàn)白色絮狀沉淀。Chenite首次在2000年，用高脫乙酰度的殼聚糖和甘油磷酸鈉混合，得到了pH值中性且在常溫下可長(zhǎng)時(shí)間保持液態(tài)的殼聚糖/甘油磷酸鈉(GP)復(fù)合物。這種混合物具有溫敏活性,即在室溫或低于室溫時(shí)可保持液態(tài)較長(zhǎng)時(shí)間,而溫度升高到生理體溫(37℃)后發(fā)生凝膠化。其研究小組進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)[9]，殼聚糖的脫乙酰度對(duì)于此殼聚糖/GP凝膠體系的影響較大。當(dāng)殼聚糖的脫乙酰度越低時(shí)，凝膠所需要的溫度越高，而且相應(yīng)凝膠化的時(shí)間也越長(zhǎng)一些。殼聚糖的分子量則對(duì)于凝膠溫度的影響不是很大。而當(dāng)殼聚糖的脫乙酰度以及濃度保持不變時(shí)，GP的濃度直接影響著凝膠的溫度，當(dāng)GP升高時(shí)，pH上升，凝膠溫度下降。與此同時(shí)，裸鼠體內(nèi)的炎性反應(yīng)實(shí)驗(yàn)也表明，殼聚糖/GP中殼聚糖的脫乙酰度越高其生物相容性越好[10]。

對(duì)于這種水凝膠的凝膠原理，人們到現(xiàn)在仍然沒(méi)有得出確切的結(jié)論，但是研究者對(duì)此還是形成了一些初步的認(rèn)識(shí)。起初，研究者認(rèn)為是由于加入了GP之后，由于溫度的上升，GP與殼聚糖之間的分子力上升而使得溶液中疏水作用的增強(qiáng)從而引起凝膠化[6,9，11]。但是隨后的研究認(rèn)為，由于溫度升高，兩者之間的離子間的分子作用力反而是降低的，是由于殼聚糖中的陽(yáng)離子胺基基團(tuán)與GP中的磷酸鹽陰離子發(fā)生質(zhì)子的轉(zhuǎn)換，才使得凝膠化形成[12]。之后的實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，使用雙蒸水清洗的殼聚糖/GP基水凝膠中的N和P物質(zhì)是可以移除的，從而證明GP并沒(méi)有通過(guò)離子力或者共價(jià)力與殼聚糖相交聯(lián)[13]。所以，殼聚糖/GP基的水凝膠屬于物理交聯(lián)的水凝膠，相比其他一些用化學(xué)交聯(lián)劑制備的殼聚糖及其衍生物水凝膠，其制備方法顯得更加綠色環(huán)保。

2.殼聚糖/GP基水凝膠作為緩釋系統(tǒng)的應(yīng)用

由于殼聚糖/GP基水凝膠的pH值接近中性，而且是通過(guò)物理交聯(lián)的水凝膠，在交聯(lián)的過(guò)程中避免了使用化學(xué)交聯(lián)劑，所以它非常適合作為一些敏感大分子如蛋白質(zhì)及肽類藥物的載體。Ruel-Garie′py等人[14]首次將殼聚糖/GP應(yīng)用到藥物緩釋的研究。隨后，他們又嘗試殼聚糖/GP對(duì)親水性小分子類脂質(zhì)體的緩釋，也取得了良好的效果[15]。2004年，研究小組又將另一種疏水性的抗腫瘤藥物紫杉醇與殼聚糖/GP水凝膠復(fù)合[16]，發(fā)現(xiàn)紫杉醇在殼聚糖/GP中體外緩釋的時(shí)間超過(guò)了一個(gè)月。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中他們將復(fù)合藥物的凝膠直接注射到鼠的乳腺腫瘤中，對(duì)腫瘤的抑制作用明顯，且相比較傳統(tǒng)的藥物使用方法，這種局部用藥具有全身毒性作用小的優(yōu)點(diǎn)。最近，Sung wooKim等人[17]利用殼聚糖/GP復(fù)合另一種用于腫瘤化學(xué)治療的鞣花酸(ellagic acid)，發(fā)現(xiàn)其對(duì)兩種腦部腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)有著明顯的抑制作用。

Wu等[18]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)緩釋藥物時(shí)，殼聚糖/GP水凝膠在酸性或堿性條件下均發(fā)生較強(qiáng)的突釋，而在用季銨鹽殼聚糖與GP構(gòu)建的水凝膠中，藥物緩釋顯得較為緩慢。隨后，其研究小組還利用聚乙稀醇(PEG)與殼聚糖交聯(lián)，制備了殼聚糖-PEG/GP水凝膠體系用作鼻類藥物載體，發(fā)現(xiàn)其無(wú)毒性，而且有利于親水性大分子藥物鼻內(nèi)的黏附釋放[19]。吉秋霞等也利用改性的季銨鹽殼聚糖與GP制備水凝膠緩釋洗必泰，發(fā)現(xiàn)其對(duì)某些牙周致病菌有著良好的抑制作用[20]。此外，第四軍醫(yī)大學(xué)馬志偉等人[21]嘗試?yán)脷ぞ厶?GP溫敏水凝膠雙緩釋骨形成蛋白和氯己定用于牙周組織再生的初步實(shí)驗(yàn)研究，也取得了一定的效果。由此可見(jiàn)，殼聚糖/GP基水凝膠能適用于多種用途的緩釋。

3.殼聚糖/GP基水凝膠在組織工程及再生醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用

3.1 軟骨組織工程的應(yīng)用

由于局部血供不足，膝關(guān)節(jié)軟骨的自我再生能力很差，細(xì)胞治療就被認(rèn)為是很希望的軟骨再生的修復(fù)方式，但在軟骨細(xì)胞的培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，在經(jīng)過(guò)三四代培養(yǎng)后，軟骨細(xì)胞往往失去分泌軟骨基質(zhì)的能力。而殼聚糖在結(jié)構(gòu)上與軟骨基質(zhì)中的糖胺聚糖(GAG)以及透明質(zhì)酸很相似，所以Hoemann等人[22]利用殼聚糖/GP水凝膠模擬軟骨的細(xì)胞外基質(zhì)復(fù)合軟骨細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)軟骨細(xì)胞在支架中生長(zhǎng)良好，仍然發(fā)揮其軟骨細(xì)胞表型。隨后，其研究小組將殼聚糖/GP與自體血相復(fù)合，進(jìn)行一系列的體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)，成骨的在軟骨缺損的動(dòng)物模型上取得了成功的軟骨再生[23-25]。國(guó)內(nèi)的研究者將羥乙基纖維素(HEC)加入殼聚糖/GP中提高了其力學(xué)性能，也在山羊的膝軟骨缺損模型中取得了修復(fù)成功[26]。除此之外，殼聚糖/GP優(yōu)越的可注射性能使得軟骨缺損的微創(chuàng)治療變得十分的可行，具有十分良好的臨床應(yīng)用前景。

3.2 骨組織工程的應(yīng)用

殼聚糖很早就被作為支架材料單獨(dú)或者聯(lián)合的應(yīng)用到骨組織工程中，被證明其具備良好的骨傳導(dǎo)性能，以及一定的促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖的作用[27]。Kyung Sook Kim等人[28]嘗試將鼠肌肉來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞與殼聚糖/GP復(fù)合，同時(shí)在殼聚糖/GP中預(yù)先混合了一定比例的成骨誘導(dǎo)液，將其植入裸鼠皮下，四周后的組織切片的von kossa染色陽(yáng)性，而且同時(shí)還發(fā)現(xiàn)支架中復(fù)合的間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)侵潤(rùn)的宿主炎性細(xì)胞有免疫抑制作用。其研究小組還發(fā)現(xiàn)，骨組織工程中使用最廣泛，研究最多的骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞也在殼聚糖/GP水凝膠中生長(zhǎng)良好[29]。他們認(rèn)為殼聚糖/GP有著良好的骨組織工程支架材料應(yīng)用潛力。

3.3 心肌組織工程

心肌梗塞造成心肌細(xì)胞缺失，對(duì)局部缺血以及壞死部位的細(xì)胞治療面臨著移植細(xì)胞的存留率以及存活率不高的困境，國(guó)內(nèi)軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院盧文寧等人[30，31]嘗試將胚胎干細(xì)胞加入到殼聚糖/GP水凝膠中，植入到局部心肌梗塞的鼠模型中，四周后，梗塞區(qū)域的心臟功能，心室壁厚度，以及血管密度均顯著高于對(duì)照組。他們認(rèn)為殼聚糖/GP水凝膠是一種非常適宜的心肌細(xì)胞載體能被應(yīng)用于心肌組織工程。

3.4 其他

和軟骨組織一樣，髓核也是一種無(wú)血管的組織，其自身的再生能力很差，Roughley等人[32-34]將殼聚糖/GP與髓核細(xì)胞相復(fù)合，一系列的體內(nèi)體外研究顯示，殼聚糖/GP水凝膠也取得了良好的髓核再生修復(fù)的效果。此外殼聚糖/GP還被應(yīng)用到神經(jīng)及腦再生修復(fù)等領(lǐng)域中[35，36]。

4.小結(jié)與展望

綜上所述，殼聚糖/GP基水凝膠是一種良好的細(xì)胞與藥物的載體，可以被用于藥物緩釋以及組織工程等眾多領(lǐng)域。但是，雖然殼聚糖/GP水凝膠在生物醫(yī)藥領(lǐng)域的多個(gè)方向已經(jīng)有所建樹(shù)，但它也存在著一些自身的缺點(diǎn)，如力學(xué)性能較差。此外，單一使用一種材料構(gòu)建的支架材料作用比較有限，今后，我們可以嘗試將殼聚糖進(jìn)行改性，如之前提到的季銨鹽殼聚糖，或者與一些合成的高分子多聚物如聚乙烯醇(PEG)、聚乙烯亞胺(polyethyleneimine，PEI)等進(jìn)行接枝，又或者與其他的一些天然或者合成的生物性能好的材料比如膠原，PLGA，TCP等與殼聚糖進(jìn)行有效的物理交聯(lián)，力圖發(fā)揮各自材料的優(yōu)點(diǎn)，彌補(bǔ)對(duì)方的缺點(diǎn)，構(gòu)建一種能發(fā)揮多種功效的智能的復(fù)合型水凝膠支架材料。

[1]A.S.Hoffman,Hydrogels for biomedical applications[J].Adv Drug Delivery Rev，2002，54：3

[2]Jeanie L.Drury,David J.Mooney，Hydrogels for tissue engineering：scaffold design variables and applications[J].Biomaterials,2003，24：4337-4351

[3]C.R.Nuttelman,S.M.Henry,K.S.Anseth,Synthesis and characterization of photocrosslinkable,degradable poly(vinylalcohol)-based tissue engineering scaffolds[J].Biomaterials，2002，23：3617

[4]A.Goessl,N.Tirelli,J.A.Hubbell,A hydrogel system for stimulus-responsive,oxygen-sensitive in situ gelation[J].J.Biomater.Sci.Polym.Ed,2004，15：895

[5]Bae JW,Go DH,Park KD.Thermosensitive chitosan as an injectable carrier for local drug delivery[J].Macromolecular Res，2006，14(4)：461-465

[6]Chenite A,Chaput C,Wang D,Combes C,Buschmann MD,Hoemann CD,Leroux JC,Atkinson BL,Binette F,Selmani A.Novel injectable neutral solutions of chitosan form biodegradable gels in situ[J].Biomaterials，2000，21：2155-2161

[7]Kim IY,Seo SJ,Moon HS,Yoo MK,Park IY,Kim BC,et al.Chitosan and its derivatives fortissue engineering applications.Biotechnol Adv，2008，26：1-21

[8]賈洪誠(chéng),王 璇,李曉光,柳月紅.殼聚糖和氯己定協(xié)同抗菌斑作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].中華老年口腔醫(yī)學(xué)雜志，2010，01：011

[9]Chenite A,Buschmann M,Wang D,Chaput C,Kandani N.Rheological characterization of thermogelling chitosan/glycerol-phosphate solutions[J].Carbohydr Polym，2001，46：39-47

[10]Molinaro G,Leroux JC,DamasJ,Adam A.Biocompatibility of thermo-sensitive chitosan-based hydrogels：an in vivo experimental approach to injectable biomaterials[J].Biomaterials，2002，23：2717-2722

[11]Cho J,Heuzey MC,Begin A,Carreau PJ.Physical gelation of chitosan in the presence of beta-glycerophosphate：the effect of temperature[J].Biomacromolecules， 2005， 6：3267-3275

[12]LavertuM,FilionD,BuschmannMD.Heat-induced transfer of protons from chitosan to glycerol phosphate produces chitosan precipitation and gelation[J].Biomacromolecules，2008，9：640-650

[13]Iliescu M,Hoemann CD,Shive MS,Chenite A,Buschmann MD.Ultrastructure of hybrid chitosan–glycerol phosphate blood clots by environmental scanning electron microscopy[J].Microsc Res Tech，2008，71：236-247

[14]Ruel-Garie′py,A.Chenite,C.Chaput,S.Guirguis,J.-C.Leroux,Characterization of thermosensitive chitosan gels for the sustained delivery of drugs[J].Int.J.Pharm，2000，20：389-398

[15]Ruel-Garie′py,et al.Thermosensitive chitosan-based hydrogel containing liposomes for the delivery of hydrophilic molecules[J].J Control Release，2002，2182(2-3)：373-383

[16]Ruel-Garie′py,Shive M,Bichara A,Berrada M,Garrec DL,Chenite A,et al.A thermo-sensitive chitosan-based hydrogel for the local delivery of paclitaxel[J].Eur J Pharm Biopharm，2004，57：53-63

[17]Sungwoo Kim etal.A chitosan/b-glycerophosphate thermo-sensitive gel for the delivery of ellagic acid for the treatment of brain cancer[J].Biomaterials， 2010， 31：4157-4166

[18]Wu J,Su ZG,Ma GH.A thermo-and pH-sensitive hydrogel composed of quaternized chitosan/glycerophosphate[J].Int J Pharm，2006，315：1-11

[19]Wu J,Wei W,Wang LY,Su ZG,Ma GH.A thermosensitive hydrogel based on quaternized chitosan and poly(ethylene glycol)for nasal drug delivery system[J].Biomaterials,2007，28：2220-2232

[20]Qiu Xia Jiet al.A novelinjectable chlorhexidine thermosensitive hydro gel forper iodontal application：preparation,antibacterial activity and toxicity evaluation[J].J Mater Sci： Mater Med，2010，21：2435-2442

[21]馬志偉，張勇杰，吳織芬,等.骨形成蛋白和氯己定雙緩釋的殼聚糖溫敏凝膠用于牙周組織再生的實(shí)驗(yàn)研究[J].華西口腔醫(yī)學(xué)雜志，2008，45(5)：273-277

[22]Hoemann CD,Sun J,Le′gare′A,McKee MD,Buschmann MD.Tissue engineering of cartilage using an injectable and adhesivechitosanbasedcell-delivery vehicle[J].Osteoarthritis Cartilage，2005，13： 318-329

[23]Hoemann CD,Hurtig M,Rossomacha E,Sun J,Chevrier A,Shive MS,et al.Chitosan-glycerol phosphate/blood implants improve hyaline cartilage repair in ovine microfracture defects[J].J Bone Joint Surg Am，2005，87：2671-2686

[24]Hoemann CD,Chenite A,Sun J,Hurtig M,Serreqi A,Buschmann MD,et al.Cytocompatible gel formation of chitosan-glycerol phosphate solutions supplemented with hydroxyl ethyl cellulose is due to the presence of glyoxal[J].J Biomed Mater Res A，2007，56(2)：521-529

[25]ChevrierA,HoemannCD,SunJ,BuschmannMD.Chitosan-glycerol phosphate/blood implants increase cell recruitment,transient vascularization and subchondral bone remodeling in drilled cartilage defects[J].Osteoarthritis Cartilage，2007，15：316-327

[26]T.Hao et al.The support of matrix accumulation and the promotion of sheep articular cartilage defects repair in vivo by chitosan hydrogels[J].Osteoarthritis and Cartilage，2010，18：257-265

[27]Khor,E.and Lim,L.Y.Implantable Applications of Chitin and Chitosan[J].Biomaterials，2003，24(13)：2339-2349

[28]Kim KS,Lee JH,Ahn HH,Lee JY,Khang G,Lee B,et al.The osteogenic differentiation of rat muscle-derived stem cells in vivo within in situ-forming chitosan scaffolds[J].Biomaterials,2008，29：4420-4428

[29]Cho MH,Kim KS,Ahn HH,Kim MS,Kim SH,Khang G,Lee B,Lee HB.Chitosan gel as an in situ-forming scaffold for rat bone marrow mesenchymal stem cells in vivo[J].Tissue Eng Part A，2008，14(6)：1099-1108

[30]Shuanghong Lü,Haibin Wang,Wenning Lu et al.Both the Transplantation ofSomaticCellNuclearTransfer-and Fertilization-Derived Mouse Embryonic Stem Cells with Temperature-Responsive Chitosan Hydrogel Improve Myocardial Performance in Infarcted Rat Hearts Both the Transplantation ofSomatic CellNuclear Transferand Fertilization-Derived Mouse Embryonic Stem Cells with Temperature-Responsive Chitosan Hydrogel Improve Myocardial Performance in Infarcted Rat Hearts[J].Tissue Engineering Part A，2010，16：4，1303-1315

[31]Lu WN et al.Functional improvement of infracted heart by co-injection of embryonic stem cells with temperatureresponse chitosan hydrogel[J].Tissue Engineering Part A，2009，15：1437

[32]Roughley P,Hoemann C,DesRosiers E,Mwale F,Antoniou J,Alini M.The potential of chitosan-based gels containing intervertebral disc cells for nucleus pulposus supplementation[J].Biomaterials，2006，27：388-396

[33]Crompton KE,Goud JD,Bellamkond RV,Gengenbach TR,Finkelstein DI,Forsythe JS,et al.Polylysine-functionalised thermoresponsive chitosan hydrogel for neural tissue engineering[J].Biomaterials，2007，28：441-449

[34]Richardson,S.M.,Hughes,N.,Hunt,J.A.,Freemont,A.J.and Hoyland,J.A.Human Mesenchymal Stem Cell Differentiation to NP-likeCellsin Chitosan-glycerophosphate Hydrogels[J].Biomaterials，2008，29(1)：85-93

[35]Crompton, K.E., Tomas, D.and Finkelstein, D.I.Inflammatory Response on Injection of Chitosan/GP to the Brain[J].J.Mater.Sci.： Mater.Med.2006，17(7)： 633-639

[36]K.E.Crompton et al.Polylysine-functionalised thermoresponsive chitosan hydrogel for neural tissue engineering[J].Biomaterials，2007，28：441-449