快速鑒定格爾德霉素產(chǎn)生菌——吸水鏈霉菌17997中的洋橄欖葉素

李書芬，武臨專，陳菲菲,2，王紅遠(yuǎn)，孫桂芝，王以光

1 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院/北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 醫(yī)藥生物技術(shù)研究所 衛(wèi)生部抗生素生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100050

2 中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)四川抗菌素工業(yè)研究所，成都 610052

在對(duì)格爾德霉素 (Geldanamycin，GDM；一種苯醌型安莎類抗生素) 產(chǎn)生菌吸水鏈霉菌Streptomyces hygroscopicus 17997的次級(jí)代謝產(chǎn)物進(jìn)行研究時(shí)，發(fā)現(xiàn)其發(fā)酵上清液具有抗革蘭陽(yáng)性菌活性[1]。格爾德霉素具有抗真菌活性，但不具有抗革蘭陽(yáng)性菌活性。萘安莎類抗生素如利福霉素(Rifamycin)、萘霉素 (Naphthomycin) 和紅迪菌素(Rubradirin) 等，具有顯著的抗革蘭陽(yáng)性菌活性。在吸水鏈霉菌17997的基因組DNA中存在可能負(fù)責(zé)萘安莎類抗生素生物合成的基因[1-3]，因而曾經(jīng)推測(cè)該菌株具有萘安莎類抗生素產(chǎn)生潛能，但是該推測(cè)始終沒有得到證實(shí)。

本研究對(duì)吸水鏈霉菌 17997產(chǎn)生的一個(gè)具有抗革蘭陽(yáng)性菌活性化合物進(jìn)行了快速鑒定，確證為洋橄欖葉素 (Elaiophylin；又稱阿沙霉素B，azalomycin B；化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖1)，具體報(bào)道如下。

圖1 洋橄欖葉素化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig. 1 Chemical structure of elaiophylin.

1 材料與方法

1.1 材料

菌種：吸水鏈霉菌17997，GDM產(chǎn)生菌；枯草芽胞桿菌 63501，革蘭陽(yáng)性檢定菌；上述菌株均為本實(shí)驗(yàn)室保藏。

培養(yǎng)基：ISP2培養(yǎng)基：酵母提取物0.4%，麥芽提取物1.0%，葡萄糖0.4%，瓊脂粉1.8%。液體發(fā)酵培養(yǎng)基：淀粉2%，棉子餅粉0.5%，葡萄糖0.5%，玉米漿1.0%，酵母粉0.5%，CaCO30.2%。生物檢定培養(yǎng)基：蛋白胨0.6%，牛肉膏0.3%，酵母膏0.3%，葡萄糖0.1%，瓊脂1.2%，pH 7.2。

試劑：酵母提取物 (Yeast extract)、麥芽提取物 (Malt extract)，英國(guó)Oxoid公司產(chǎn)品，葡萄糖為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?。TLC硅膠板 (GF254)，山東煙臺(tái)吉德精細(xì)化工有限公司或青島海洋化工分廠產(chǎn)品。乙酸乙酯 (EtOAc)、甲醇、二氯甲烷、環(huán)己烷等有機(jī)溶劑為北京化工廠分析純?cè)噭?。洋橄欖葉素對(duì)照品由中國(guó)科學(xué)院成都生物研究所李國(guó)友博士惠贈(zèng)[4]，以及澳大利亞 Bioaustralis 公司產(chǎn)品。PCR引物及相關(guān)試劑由寶生物工程 (大連) 有限公司合成或提供。

1.2 方法

吸水鏈霉菌 17997的培養(yǎng)與發(fā)酵：新鮮的吸水鏈霉菌 17997孢子斜面 (ISP2培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)7~10 d，挖塊接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基，28 ℃振蕩(200 r/min) 培養(yǎng)48~96 h。發(fā)酵液離心后，棄沉淀；發(fā)酵上清液用于乙酸乙酯 (EtOAc) 提取分析等。

EtOAc提?。喝∥溍咕?7997發(fā)酵上清液25 mL，用等體積EtOAc萃取，傾出EtOAc萃取液，室溫吹干，復(fù)溶于約0.5 mL EtOAc中。

硅膠板TLC分離檢測(cè)以及NaOH顯色：取上述20 μL EtOAc提取物濃縮液，硅膠板TLC初步分離，在EtOAc∶二氯甲烷∶正己烷∶甲醇 (9∶6∶6∶2，V/V/V/V) 溶媒系統(tǒng)中展開后，用2.0 mol/L NaOH溶液噴涂 (一種針對(duì)格爾德霉素及其生物合成類似物的顯色方法[5])，照相記錄。

抗革蘭陽(yáng)性菌活性檢測(cè)：將上述 TLC硅膠板(沒有用NaOH溶液噴涂顯色) 貼到含枯草芽胞桿菌63501的生物檢定培養(yǎng)基平板上約1 min，揭去硅膠板，將平板置于37 ℃培養(yǎng)16 h，平板上透明帶對(duì)應(yīng)的硅膠板條帶含有抗革蘭陽(yáng)性菌活性化合物。

HPLC和LC-MS：將硅膠板上含有抗菌活性化合物的條帶用EtOAc洗脫下來(lái)后，吹干，復(fù)溶于少量甲醇中，進(jìn)行HPLC和LC-MS分析。HPLC分析：Dikma Diamonsil C18反相色譜柱，(5 μm，150 mm× 4.6 mm)；20%~100%甲醇梯度洗脫，30 min；流速1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)256 nm。LC-MS分析：Agilent 1200液相色譜系統(tǒng)與 Applied Biosystems/MSD SCIEX (Concord，Ont，Canada) 公司的Qstar LC-MS質(zhì)譜儀聯(lián)用，配有Turbo Ionspray離子化源。液相色譜條件同HPLC。質(zhì)譜檢測(cè)條件：噴霧電壓5.5 kV；溫度450 ℃；解簇電壓80 V；霧化氣40相對(duì)單位，輔助氣30相對(duì)單位，均為氮?dú)猓蝗珤呙璞O(jiān)測(cè)，正離子方式，質(zhì)荷比 (m/z) 范圍為 100~1 300；采用信息依賴掃描模式獲得二級(jí)質(zhì)譜；碰撞壓力設(shè)為高；碰撞能量為50eV。

dTDP-葡萄糖-4,6-脫水酶基因保守區(qū)的 PCR擴(kuò)增：上游引物P1序列5′-GSGGSGSSGCSGGSTTC ATSGG-3′，下游引物P2序列5′-GGGWRCTGGYRS GGSCCGTAGTTG-3′[6]；其中，R=A/G，W=A/T，Y=C/T，S=C/G。吸水鏈霉菌17997總DNA (PCR模板) 提取，微波法[7]；使用寶生物工程 (大連) 有限公司Taq LA聚合酶、GC Buffer I進(jìn)行PCR，PCR主要參數(shù)為：96 ℃變性30 s，65 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)。

2 結(jié)果與討論

2.1 抗菌活性化合物的HPLC分析

在對(duì)吸水鏈霉菌 17997次級(jí)代謝產(chǎn)物分析時(shí)，發(fā)現(xiàn)一條在TLC硅膠板上用NaOH溶液噴涂顯紅色的條帶 (圖 2)。抗菌活性分析顯示：該紅色條帶所對(duì)應(yīng)的化合物 (未顯色) 具有抗革蘭陽(yáng)性菌活性。將該條帶所含化合物從硅膠板上洗脫下來(lái)后進(jìn)行HPLC分析，出現(xiàn)一個(gè)顯著的洗脫峰，其紫外吸收峰形與保留時(shí)間均與文獻(xiàn)報(bào)道的洋橄欖葉素基本一致[8-9]。有報(bào)道在格爾德霉素產(chǎn)生菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)洋橄欖葉素[9-10]。

圖2 吸水鏈霉菌 17997發(fā)酵液乙酸乙酯提取物經(jīng) TLC硅膠板分離后用2.0 mol/L NaOH溶液噴涂顯色結(jié)果Fig. 2 Color reaction by spraying 2.0 mol/L NaOH onto the TLC silica gel of EtOAc extract of the fermentation supernatant of Streptomyces hygroscopicus 17997.

圖3 吸水鏈霉菌17997所產(chǎn)生的抗革蘭陽(yáng)性菌活性化合物的HPLC譜圖Fig. 3 HPLC profile of the compound with anti-Gram positive bacteria activity from Streptomyces hygroscopicus 17997.

對(duì)吸水鏈霉菌17997菌絲體用丙酮浸泡提取和分析后，發(fā)現(xiàn)更多的NaOH溶液噴涂顯紅色化合物，這與洋橄欖葉素作為次級(jí)代謝產(chǎn)物主要存在于菌絲體內(nèi)的報(bào)道相符合[11]。將該化合物與洋橄欖葉素對(duì)照品混和后進(jìn)行HPLC分析，二者的保留時(shí)間和紫外吸收峰形一致；洋橄欖葉素對(duì)照品在TLC硅膠板上用NaOH溶液噴涂顯示相同的紅色。因此，該化合物很可能是洋橄欖葉素。

2.2 吸水鏈霉菌17997基因組DNA含有洋橄欖葉素dTDP-葡萄糖-4,6-脫水酶 (Tgd) 基因

洋橄欖葉素化學(xué)結(jié)構(gòu)中含有 2-脫氧-L-巖藻糖(2-deoxy-L-fucose) 組分。已知葡萄糖通過(guò)磷酸化、dTDP化、脫水、還原、差向異構(gòu)化等反應(yīng)生成 2-脫氧-L-巖藻糖，再經(jīng)糖基轉(zhuǎn)移酶催化進(jìn)入到洋橄欖葉素分子中；2-脫氧-L-巖藻糖的生物合成需要Tgd[12]。采用tgd基因保守區(qū)設(shè)計(jì)的引物，以吸水鏈霉菌17997基因組DNA為模板，PCR得到一條預(yù)計(jì)大小 (約0.6 kb) 的特異性DNA條帶 (圖4)。對(duì)該 DNA條帶進(jìn)行測(cè)序 (GenBank Accession No. HQ260658)，它所編碼的氨基酸序列，與美國(guó)專利US 7595187報(bào)道的洋橄欖葉素生物合成基因簇中dTDP-葡萄糖-4,6-脫水酶基因 (EMBL Accession No. GP697132) 保守區(qū)編碼氨基酸序列幾乎完全相同 (Identities=154/158 (97%)，Positives=156/158 (98%)，Gaps=1/158 (0%))[13]，從而確證PCR擴(kuò)增的 DNA片段屬于洋橄欖葉素生物合成基因簇中的tgd基因保守區(qū)。吸水鏈霉菌17997中存在洋橄欖葉素tgd基因，提示其具有產(chǎn)生洋橄欖葉素的遺傳基礎(chǔ)。

2.3 抗菌活性化合物與洋橄欖葉素具有相同的LC-MS譜

圖4 PCR擴(kuò)增吸水鏈霉菌17997中的tgd保守區(qū)Fig. 4 PCR amplification of the conserved region of tgd from Streptomyces hygroscopicus 17997. 1: DNA marker; 2: the conserved region of tgd (600 bp) from Streptomyces hygroscopicus 17997.

圖5 吸水鏈霉菌17997中產(chǎn)生的抗菌活性化合物的二級(jí)MS譜圖Fig. 5 The MS2 profile of the compound with antibacterial activity from Streptomyces hygroscopicus 17997.

為了確證吸水鏈霉菌 17997中的抗革蘭陽(yáng)性菌活性化合物為洋橄欖葉素，對(duì)其進(jìn)行了LC-(+)-ESIMS分析 (圖5)：MS1顯示一個(gè)m/z=1 047.7的加合離子 ([M+Na]＋)，其MS2主要碎片離子為m/z=729.4和 411.2。已知洋橄欖葉素的分子式為 C54H88O18，精確分子質(zhì)量 1 024.60。該化合物與文獻(xiàn)所述的洋橄欖葉素MS1和MS2結(jié)果一致[14]。其中，m/z=729.4碎片離子系分子丟失兩個(gè) 2-脫氧-L-巖藻糖組分形成，m/z=411.2碎片離子系分子的內(nèi)酯環(huán)組分進(jìn)一步脫水形成。因此，該抗菌活性化合物被證實(shí)為洋橄欖葉素。

3 討論

吸水鏈霉菌是鏈霉菌屬中的一個(gè)比較常見種。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，吸水鏈霉菌能夠產(chǎn)生100多種不同的次級(jí)代謝產(chǎn)物；此外，同一菌株產(chǎn)生一種以上不同化學(xué)結(jié)構(gòu)的抗生素并不少見。洋橄欖葉素是一種大環(huán)二內(nèi)酯類抗生素，在雷帕霉素 (Rapamycin)、尼日利亞菌素 (Nigericin) 和除莠霉素 (Herbimycin) 等抗生素產(chǎn)生菌 (屬于吸水鏈霉菌) 的次級(jí)代謝產(chǎn)物中均發(fā)現(xiàn)了洋橄欖葉素[15-16]。

近年來(lái)，對(duì)微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物、特別是抗生素的生物合成機(jī)制有了越來(lái)越多的研究和認(rèn)識(shí)，并積累了大量的抗生素生物合成基因 (簇) 序列信息?；谔囟ㄉ锖铣杀匦杌虻谋Ｊ匦蛄性O(shè)計(jì)寡核苷酸引物，通過(guò)PCR可以快速篩選潛在的具有特定化學(xué)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)的抗生素產(chǎn)生菌[17-19]；再通過(guò)序列分析與比對(duì)，可以為推測(cè)菌株可能產(chǎn)生的抗生素化學(xué)結(jié)構(gòu)或類型提供重要的提示或參考。本文通過(guò)證實(shí)吸水鏈霉菌17997含有dTDP-葡萄糖-4,6-脫水酶基因，并通過(guò)序列分析表明它屬于洋橄欖葉素生物合成基因簇中與2-脫氧-L-巖藻糖生物合成相關(guān)的dTDP-葡萄糖-4,6-脫水酶基因，提示該菌株具有產(chǎn)生洋橄欖葉素的遺傳基礎(chǔ)，為推測(cè)抗革蘭陽(yáng)性菌活性化合物為洋橄欖葉素提供了重要的參考。

洋橄欖葉素具有抗革蘭陽(yáng)性菌、抗線蟲、抗原生動(dòng)物、免疫抑制和抗哺乳動(dòng)物腫瘤細(xì)胞等多種生物學(xué)活性；在基于單純的生物活性篩選模式的微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物研究中，被重復(fù)發(fā)現(xiàn) (分離純化和化學(xué)結(jié)構(gòu)解析) 多次。本文報(bào)道了洋橄欖葉素及其產(chǎn)生菌的一種快速、簡(jiǎn)易鑒定方法；其中，洋橄欖葉素在TLC硅膠板上用NaOH溶液噴涂顯紅色的特性屬于首次報(bào)道，其ESI(+)-MS2譜圖是首次公開給出，適用于洋橄欖葉素類化合物及其產(chǎn)生菌的早期快速鑒別和排重。洋橄欖葉素用NaOH溶液處理顯紅色的原理，推測(cè)是由于分子中的內(nèi)酯鍵在堿性條件下發(fā)生水解后分子再脫水增加一個(gè)共軛雙鍵，以及分子生成鈉鹽所致。

致謝：中國(guó)科學(xué)院成都生物研究所李國(guó)友博士惠贈(zèng)洋橄欖葉素對(duì)照品。中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所分析中心完成LC-MS分析。

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