李 勇 胡興明 鄧 文 葉楚華

(湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所,湖北武漢 430070)

桑葉功能活性物質(zhì)提取工藝研究進(jìn)展

李 勇 胡興明 鄧 文 葉楚華

(湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所,湖北武漢 430070)

對(duì)近年來有關(guān)桑葉中多糖類、黃酮類及生物堿類活性物質(zhì)的提取工藝研究進(jìn)行了綜述,為桑葉資源進(jìn)一步的研究和開發(fā)提供依據(jù)。

桑葉;活性物質(zhì);多糖;黃酮;生物堿;提取工藝

中國(guó)是桑樹的故鄉(xiāng)也是世界上主要的桑葉產(chǎn)地之一。桑葉為桑屬植物桑樹(Morus alba L.)的葉子,隨著科技的不斷進(jìn)步,人們對(duì)桑葉的化學(xué)成分、生理功能進(jìn)行了深入研究,發(fā)現(xiàn)桑葉中含有豐富的多糖類、黃酮類和生物堿類等多種功能活性成分,具有降血糖、降血壓、降血脂及抗病毒等諸多功效［1］。桑葉因其極高的營(yíng)養(yǎng)、藥用價(jià)值,已成為食品、醫(yī)藥界關(guān)注的熱點(diǎn)。為此,我們對(duì)近年來有關(guān)桑葉中多糖類、黃酮類及生物堿類等主要功能活性物質(zhì)的提取工藝研究進(jìn)展進(jìn)行綜述,以期為合理開發(fā)利用桑葉資源提供依據(jù)。

1 桑葉多糖類活性物質(zhì)提取工藝研究

多糖是所有生命有機(jī)體的重要組成成分與維持生命所必需的結(jié)構(gòu)材料,參與生物細(xì)胞的各種活動(dòng),具有多方面的生物活性和功能?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)證明,桑葉總多糖對(duì)四氧嘧啶造成的大鼠糖尿病有顯著的降血糖作用,而且多糖作為藥物對(duì)人和動(dòng)物沒有毒副作用［2］,因而對(duì)于桑葉多糖的研究已引起人們的極大興趣。多糖的提取方法很多,一般桑葉多糖多采用水浸提,或輔以微波法、超聲波法、酶法或超高壓法等處理方法來提取分離。

1.1 水浸提法

桑葉多糖的水浸提法工藝一般是桑葉經(jīng)超微粉碎后,于適量蒸餾水中保持恒溫提取一定時(shí)間,經(jīng)離心、濃縮、Sevag法或其它方法脫蛋白、無水乙醇沉淀和干燥處理等工藝得桑葉粗多糖。劉詠［3］利用水煮醇沉法從桑葉中提取可溶性多糖,通過 Sevag法除蛋白,粗多糖過葡聚糖凝膠(Sephadex G-100)柱層析進(jìn)行純化分離,用苯酚—硫酸法測(cè)定多糖含量,并用聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行純度檢查,通過正交試驗(yàn)確定了提取桑葉多糖的優(yōu)化條件為水浴溫度100 ℃、桑葉 ∶水量 =1∶100(w/v)、浸提 60 min、pH值 4為最佳提取條件,其多糖含量達(dá) 98.52 mg/g(DW)。劉樹興等［4］利用水浸提法,通過三氯乙酸法除去多糖中的蛋白質(zhì),用苯酚—硫酸法測(cè)定多糖的含量,利用正交試驗(yàn)確定出桑葉多糖提取的最優(yōu)化條件為水浴溫度 100℃、pH值 1l、料液比(桑葉∶水)=1∶50(w/v)、浸提 2 h,提取率達(dá) 90.5%。張琳華等［5］采用 L9(34)正交試驗(yàn),對(duì)影響多糖的水提取工藝和醇沉分離工藝的因素水平進(jìn)行了研究,比較了稀酸、稀堿、蒸餾水 3種提取方法和不同蛋白去除法對(duì)多糖提取分離的影響,結(jié)果表明:桑葉多糖的最佳提取工藝為用 10倍的蒸餾水在 70℃下提取 2次,每次 1.5 h;醇沉分離最佳工藝是醇沉?xí)r乙醇體積分?jǐn)?shù) 80%,藥液濃縮至 1m L/g,pH值 4。用三氯乙酸(TCA)法去除蛋白質(zhì)的效果優(yōu)于傳統(tǒng)的 Savage法。應(yīng)芝等［6］利用響應(yīng)面分析法(RSM)優(yōu)化桑葉多糖的提取工藝。采用單因素試驗(yàn)選取試驗(yàn)因素與水平。根據(jù)中心組合(Box-Benhnken)試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理,采用 4因素 3水平的響應(yīng)面分析法;在分析各因素顯著性及其交互作用的基礎(chǔ)上,得出桑葉多糖的最佳提取工藝條件:提取溫度 77℃,料液比1∶17,提取時(shí)間 85min,提取 2次,實(shí)際測(cè)得的桑葉多糖得率為 4.67%,與模型預(yù)測(cè)值基本相符。

1.2 微波輔助法

隨著微波化學(xué)新技術(shù)的發(fā)展,新的微波破壁提取分離技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用于各種天然有機(jī)物的提取工藝研究。因?yàn)槌哳l率的微波快速加熱,使植物細(xì)胞部分破裂,多糖等胞內(nèi)成分易擴(kuò)散至細(xì)胞外溶劑中,從而明顯提高浸出率。

邢東旭等［7］以干燥桑葉粉為材料,在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,采用 Box-Benhnken中心組合實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面分析法,研究了提取時(shí)間、微波功率和料液比對(duì)桑葉多糖提取率的影響,確定了微波提取桑葉多糖的最佳工藝條件:微波時(shí)間 10 min,微波功率320W,料液比 1∶45,在此最優(yōu)工藝下桑葉多糖提取率的理論值為 5.45%;與熱水浸提法相比,微波法提取率高,且所得桑葉多糖更能明顯提高四氧嘧啶糖尿病小鼠的糖耐量,是一種更好的桑葉多糖提取方法。王尉等［8］利用微波輔助技術(shù)進(jìn)行桑葉多糖提取,通過單因素實(shí)驗(yàn)確定因素與水平,應(yīng)用 Box-Behnken設(shè)計(jì) 3因素 3水平的試驗(yàn),依據(jù)回歸分析確定了最優(yōu)的提取工藝條件,結(jié)果表明微波輔助提取桑葉多糖的優(yōu)化提取工藝條件:溫度 88℃、時(shí)間11min和液固比 18∶1,提取的多糖含量為15.20mg/g,微波輔助提取的多糖含量分別比傳統(tǒng)水提法提取10min和 60min時(shí),高 2.18倍和 0.23倍。

1.3 超聲波輔助法

超聲波是一種彈性機(jī)械振動(dòng)波,它可以產(chǎn)生強(qiáng)烈振動(dòng)、高速度、強(qiáng)烈的空化效應(yīng)以及攪拌作用,能夠破壞植物細(xì)胞的細(xì)胞膜,從而加速有效成分的釋放與溶出。與傳統(tǒng)的溶劑提取法相比,該法提取率高,提取速度快,作為植物功能活性成分提取新工藝,有很好的應(yīng)用前景。

劉學(xué)軍等［9］研究了超聲波提取桑葉多糖工藝中超聲波功率、溫度、時(shí)間和粒徑對(duì)桑葉多糖提取率的影響,并利用正交實(shí)驗(yàn)對(duì)上述 4個(gè)工藝參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化,結(jié)果表明:超聲波提取桑葉多糖的最佳工藝條件為超聲波功率 50W,提取溫度為 85℃,提取時(shí)間 2.5 h,原料粒徑 80目;在此條件下進(jìn)行 2次重復(fù)實(shí)驗(yàn)得出平均提取率為 10.74,重復(fù)性較好。王豐俊等［10］針對(duì)桑葉多糖的超聲波輔助提取,首先通過單因素試驗(yàn)選取影響因素與水平,然后在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上采用 4因素 3水平的響應(yīng)面分析法,依據(jù)回歸分析確定了較優(yōu)提取工藝條件,結(jié)果表明其較優(yōu)工藝條件:提取溫度 81.5℃,超聲波時(shí)間30 min,超聲波功率 100W,水料比 10∶1;采用該工藝條件,桑葉多糖的提取得率達(dá)到 2.99%。楊青珍等［11］通過單因素和正交試驗(yàn)設(shè)計(jì),探討了龍桑葉多糖的超聲輔助提取工藝條件,試驗(yàn)結(jié)果表明,龍桑葉多糖的最適提取工藝條件:料液比 1∶40,溫度70℃,水浴時(shí)間 2 h,超聲波處理時(shí)間 20min;采用該工藝條件,龍桑葉多糖的提取得率超過 1.00%。

1.4 酶輔助法

植物細(xì)胞內(nèi)存在著一定量的蛋白質(zhì)、纖維素、半纖維素、果膠質(zhì)等成分,這些物質(zhì)是胞內(nèi)多糖等大分子溶出的主要屏障,它們的分解有利于糖類物質(zhì)的溶出。桑葉多糖酶輔助法提取就是基于此考慮,通過添加胰蛋白酶、纖維素酶或果膠酶等對(duì)樣品進(jìn)行前處理來提高桑葉多糖的得率。

夏平等［12］研究了復(fù)合酶法(纖維素酶∶果膠酶 =1∶1)提取桑葉中多糖。通過單因素和正交試驗(yàn)研究了酶的濃度、酶作用的時(shí)間、酶作用的溫度以及酶作用的 pH值對(duì)桑葉粗多糖提取率的影響,結(jié)果表明:酶輔助法提取的最佳工藝條件為溫度 50℃、pH值 4.5、酶用量 1.0%、提取時(shí)間 1 h;提取桑葉多糖的得率可達(dá) 14.32%。王芳等［13］研究了超聲波法、酶法和微波法等不同的前處理方法對(duì)桑葉多糖提取效率的影響,結(jié)果表明:提取桑葉多糖的得率依次為酶輔助法 ＞超聲輔助法 ＞微波輔助法,其中纖維素酶為桑葉多糖的最佳酶提取劑,其酶解的較優(yōu)方案是酶用量為桑葉量的 1.5%,酶解時(shí)間 2 h,酶解溫度50℃,酶處理后水提多糖得率可達(dá) 12.49%。

1.5 超高壓輔助法

超高壓提取(UHPE)技術(shù)是一種全新的天然產(chǎn)物有效成分提取技術(shù),它是在常溫條件下,利用100 MPa以上的流體靜壓力作用于料液上,保壓一段時(shí)間(5 min左右),然后迅速卸壓,進(jìn)行萃取,達(dá)到提取的目的。該技術(shù)具有操作簡(jiǎn)單、提取率高、時(shí)間短、雜質(zhì)含量少、能耗低以及環(huán)保等優(yōu)點(diǎn),在功能食品、藥品的加工和開發(fā)應(yīng)用中具有較大的潛力和價(jià)值。

凌慶枝等［14］在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,采用正交試驗(yàn)法對(duì)桑葉多糖的超高壓提取工藝進(jìn)行了優(yōu)選。利用L9(34)進(jìn)行正交試驗(yàn),以桑葉多糖的得率為指標(biāo),考察了超高壓壓力、保壓時(shí)間、pH值和固液比(W∶V)對(duì)桑葉多糖得率的影響,結(jié)果表明:桑葉多糖的最佳提取工藝條件為超高壓壓力 300 MPa、超高壓處理時(shí)間 4.5min、pH值 9.0、固液比 1∶16時(shí),桑葉多糖的提取得率可達(dá) 2.23%。同熱浸提取和超聲提取方法相比,超高壓提取方法得率高、提取時(shí)間短,是提取桑葉多糖的適宜方法。

2 桑葉黃酮類活性物質(zhì)提取工藝研究

黃酮類化合物廣泛存在于植物的各個(gè)部位,尤其是葉部含量較高,是一種天然抗氧化劑。具有清除人體中超氧離子自由基、抗?jié)?、解痙、抗菌、抗炎、降血脂和鎮(zhèn)痛等生物活性和生理活性作用。桑葉黃酮類物質(zhì)的提取方法很多,一般多采用柱層析—醇浸提法,或輔以微波法、超聲波法或超高壓法等處理方法來提取分離。

2.1 柱層析—醇浸提法

桑葉黃酮類活性物質(zhì)的醇浸提法是將桑葉干粉煮沸、過濾,經(jīng)大孔樹脂吸附,水洗至無色后,用50%～80%質(zhì)量濃度乙醇或甲醇洗脫,洗脫液低溫濃縮干燥后得桑葉粗黃酮,利用無水乙醇溶解,再經(jīng)過濾、濃縮、干燥處理等工藝得精制桑葉黃酮類物質(zhì)。

楊虎等［15］研究了利用乙醇提取桑葉中的黃酮類物質(zhì),采用正交實(shí)驗(yàn)考察了回流提取時(shí)間、提取次數(shù)、乙醇濃度、料液比等因素對(duì)提取率的影響,確定了最佳工藝條件:回流提取時(shí)間 1.5 h,提取 3次,乙醇濃度 80%,料液比(質(zhì)量比)1∶30,提取率可達(dá)0.723%。張軍等［16］研究了不同單因子對(duì)桑葉中黃酮成分浸提效果的影響,試驗(yàn)結(jié)果表明:用 80%乙醇作溶劑,原料質(zhì)量濃度為 50.00 g/L,于 70℃、pH值 8的條件下浸提 3 h并抽提 2次的提取效果較好,提取得率超過 2.5%。陳月紅等［17］利用 L9(34)正交表優(yōu)選提取條件,通過考察上柱方法、提取方法、粉碎度對(duì)桑葉總黃酮得率的影響,探討了桑葉總黃酮的最佳提取工藝,結(jié)果表明:80目細(xì)桑葉干粉,于 16倍原料的 80%乙醇中,經(jīng)大孔樹脂柱層析回流提取 2次,每次 1 h時(shí)桑葉粗黃酮得率最佳達(dá)11%,且穩(wěn)定性良好、簡(jiǎn)便易行。

2.2 微波輔助法

李莉［18］研究了以水或 70%乙醇溶劑,微波處理或非微波處理桑葉的各種方法對(duì)提取桑葉總黃酮得率的影響,結(jié)果表明:桑葉樣品經(jīng)微波處理10 min,以 70%乙醇作溶劑提取桑葉總黃酮的浸出率最高,達(dá) 69.01%。陳菁菁等［19］采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)選出了微波萃取桑葉黃酮的最佳工藝條件,當(dāng)桑葉樣品于 12倍量 70%乙醇,60℃微波萃取20 min時(shí),桑葉黃酮得率最高,且應(yīng)用微波萃取法比傳統(tǒng)醇提法桑葉黃酮得率高 55%。胡慶國(guó)［20］研究了用微波法提取桑葉中黃酮的工藝條件,探討了微波強(qiáng)度、處理時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度和提取時(shí)間對(duì)桑葉黃酮提取率的影響,結(jié)果表明:用 175W微波強(qiáng)度處理 4 min后,以體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇,在70℃提取 2 h,得到提取物的黃酮類物質(zhì)質(zhì)量濃度比未經(jīng)微波處理的高出 18.5%。

2.3 超聲波輔助法

高中松等［21］采用醇浸提法、超聲提取法探討了從桑葉中提取總黃酮類物質(zhì)的最佳工藝,結(jié)果表明:通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn),超聲提取效果最好,其最佳條件是用濃度為 70%的乙醇,按料液比1∶15的比例浸泡 3 h,再用超聲提取 45m in,其桑葉中總黃酮類物質(zhì)的提取率可達(dá) 2.18%。王麗娟等［22］在優(yōu)化選擇桑葉總黃酮的最佳超聲提取工藝研究中,采用正交實(shí)驗(yàn)法,以提取液中總黃酮含量為考察指標(biāo),確定了桑葉總黃酮的最佳超聲提取工藝為用 20倍量 50%乙醇,超聲提取 30min;采用該工藝條件,提取液中總黃酮含量達(dá) 2.38%。李宇亮等［23］研究了基于微波破壁處理的超聲提取桑葉中黃酮的工藝,當(dāng)取料液比為 1∶8,微波破壁 3次,每次 30 s,pH值5.5時(shí),超聲提取 30min(功率 1 800W),黃酮的提取率達(dá)到 96.9%,得率為 8.74 mg/g,純度達(dá) 95.13%;且該工藝中,微波破壁結(jié)合超聲提取與傳統(tǒng)的煎煮法相比較,具有成本低、產(chǎn)物收率高、并可顯著降低提取液中雜質(zhì)含量等優(yōu)點(diǎn)。

2.4 超高壓輔助法

勵(lì)建榮等［24］研究了常溫下超高壓提取桑葉黃酮類化合物蘆丁的提取工藝,觀察了不同提取溶劑、提取壓力、溶劑與原料比、提取時(shí)間及桑葉顆粒大小等因素對(duì)桑葉蘆丁提取率的影響,并對(duì)提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化,結(jié)果表明:當(dāng)以 70%乙醇水溶液為提取溶劑,提取壓力為 500MPa,提取時(shí)間為 8 min,桑葉顆粒大小為 0.18～0.25 nm,溶劑與原料比為 20∶1時(shí),桑葉黃酮類化合物蘆丁的提取率可達(dá) 23.9mg/g。

3 桑葉生物堿類活性物質(zhì)提取工藝研究

生物堿也是桑葉的主要活性成分之一。日本學(xué)者 Asano等［25］從桑葉中分離出多種多羥基生物堿,其中 DNJ(1-脫氧野尻霉素)在桑葉中含量達(dá)0.1l%,且其作為 α-葡萄糖苷酶的抑制劑,具有降血糖、抗病毒、抗腫瘤轉(zhuǎn)移等作用;另外,DNJ還是 α-葡萄糖淀粉酶的有效抑制劑,DNJ作為載體,還可用于高純度麥芽糖酶的合成,具有較高的醫(yī)療價(jià)值。目前國(guó)內(nèi)外尤其是日本和韓國(guó)對(duì)桑葉生物堿類活性物質(zhì)藥理作用的研究較多,但對(duì) DNJ提取工藝的研究相對(duì)較少。

李宇亮等［26］研究了從桑葉中提取分離 DNJ,探討了提取劑、提取方法、料液比、提取次數(shù)、時(shí)間等因素對(duì)提取率的影響,實(shí)驗(yàn)表明:提取的最佳條件是以65%的乙醇為提取劑,按料液比 1∶8超聲強(qiáng)化細(xì)胞破碎 20 min(功率 1 800 W),732 H陽離子樹脂分離,0.25 mol/L的氨水洗脫(洗脫速度 1～2 mL/min),提取率為 95.8%,純度為 92.3%以上。胡瑞君等［27］利用微波輔助提取技術(shù)提取桑葉中生物堿 DNJ,考察了微波功率、微波處理時(shí)間、固液比和提取次數(shù)等因素對(duì) DNJ得率的影響,確定了最佳提取工藝條件:微波功率為 406W、微波處理時(shí)間1.5min、固液比 (g∶m L)為 1∶40、提取次數(shù)為 2次 ,提取率超過 80%,提取得率達(dá) 0.024%,為以后開發(fā)研制降血糖藥品和保健食品提供了可能,也為桑葉在這方面的進(jìn)一步開發(fā)利用提供了技術(shù)支持。

4 結(jié)語

當(dāng)今科學(xué)技術(shù)日新月異,先進(jìn)的提取純化和檢測(cè)設(shè)備更新?lián)Q代周期越來越短,促使提取純化工藝和檢測(cè)手段更加簡(jiǎn)單化、經(jīng)濟(jì)化。隨著提取方法的不斷完善,桑葉功能活性成分在食品、醫(yī)藥中的應(yīng)用范圍將越來越廣。我國(guó)有著豐富的桑葉資源,研究桑葉功能活性成分提取分離技術(shù),開發(fā)桑葉新用途,改善傳統(tǒng)的桑葉利用結(jié)構(gòu),對(duì)于提高桑葉的利用價(jià)值,拓寬蠶桑產(chǎn)業(yè)的經(jīng)濟(jì)基礎(chǔ),保持蠶桑產(chǎn)業(yè)的活力具有重要意義。

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S888.2

B

1007-0982(2011)02-0004-05

2010-12-20;

2011-02-18

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)(蠶桑)。

李勇(1980—),男,山東菏澤,碩士,助理研究員。

Tel:027-87106001,E-mail:liyong8057@163.com

胡興明(1963—),男,研究員,碩士生導(dǎo)師。

Tel:027-87380366,E-mail:hxm@hbaas.com