孟祥升，辛崇興，邵 晞

（江蘇省連云港市動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，江蘇連云港 222001）

腸出血性大腸桿菌（Enterohaemorrhagic Escherichia coli，EHEC）O157:H7 于 1982 年在美國被首次發(fā)現(xiàn)，此后在世界各地散發(fā)或地方流行，1996年在日本大阪地區(qū)發(fā)生流行，患者逾萬，死亡11人，1999—2000年在中國江蘇、安徽等地發(fā)生了多起食源性感染O157:H7事件，導(dǎo)致l77人死亡[1-2]。世界衛(wèi)生組織已將O157:H7列為新的食源性病原菌。O157:H7的感染因具有暴發(fā)流行趨勢、強(qiáng)烈的致病性與致死性以及抗生素治療可能會(huì)加劇病情等特點(diǎn)，已成為全球性的公共衛(wèi)生問題，因此對(duì)該菌進(jìn)行有效的防控研究成為當(dāng)前亟需解決的問題。

1 病原學(xué)

EHEC O157:H7具有一般大腸桿菌的形態(tài)特征，為革蘭氏陰性、無芽孢的直桿菌，兩端鈍圓，散在或成對(duì)，大多數(shù)菌株以周生鞭毛運(yùn)動(dòng)，但也有無鞭毛或丟失鞭毛的無動(dòng)力變異株。在普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上O157:H7表現(xiàn)為光滑型菌落，有光澤，濕潤，灰白色。最適宜生長的溫度為37℃，超過44.5℃不能生長，在75℃一分鐘即可被殺滅，但其致病因子志賀毒素的抗力卻很高，經(jīng)80℃處理30 min仍具有活性。相對(duì)耐酸和耐冷，能在pH值為2、溫度低于5℃的環(huán)境中生存，在-20℃可存活9個(gè)月。此外，對(duì)含氯消毒劑十分敏感，在有效氯含量0.4ppm以上的水體中難以存活。

EHEC O157:H7與一般大腸桿菌的基本生化特性相符，發(fā)酵多種碳水化合物，但遲緩發(fā)酵山梨糖醇，也不能產(chǎn)生葡萄糖酸苷酶。但目前已有發(fā)酵山梨醇、產(chǎn)β-葡萄糖醛酸苷酶的產(chǎn)毒性O(shè)157:H7分離株的報(bào)道。Krishnan[3]和Haldane[4]分別報(bào)道的24株和37株O157:H7菌的生化結(jié)果，其山梨醇均為陰性，而賴氨酸脫羧酶、鳥氨酸脫羧酶、棉子糖和衛(wèi)矛醇均為陽性，故以這5種生化特性作為O157:H7與普通大腸桿菌的鑒別要點(diǎn)。但葉青分離的O157:H7中2株為山梨醇陽性、棉子糖陽性，1株衛(wèi)矛醇陽性[5]。以上研究結(jié)果表明部分菌株已產(chǎn)生變異，其生化反應(yīng)也不完全一致。

2 流行病學(xué)

EHEC O157:H7感染是一種動(dòng)物源性傳染病，奶牛，尤其是放牧的小牛是其主要儲(chǔ)存宿主，從腹瀉患者、畜禽糞便、市售肉類以及豬、鴿、雞、鴨等動(dòng)物中也有分離到O157:H7的報(bào)道[6]。EHEC O157:H7的流行也與季節(jié)有關(guān)，主要發(fā)生在夏秋兩季，春冬季發(fā)病相對(duì)較少，7月到8月為發(fā)病高峰期，此外，雨季也是感染的易發(fā)季節(jié)。

EHEC O157:H7可通過多種途徑傳播，其中以食源性傳播為主，水源性傳播和接觸傳播也是重要的傳播途徑。O157:H7具有較強(qiáng)的感染力，一般大腸桿菌需要100萬個(gè)活菌才可引起發(fā)病，而O157:H7只需100到200個(gè)活菌即可突破胃酸屏障，引發(fā)感染。各年齡段人群對(duì)O157:H7都易感，但兒童和老年人最易發(fā)病且癥狀較為嚴(yán)重，容易并發(fā)溶血性尿毒綜合癥和血小板減少性紫癜。根據(jù)現(xiàn)有的報(bào)道分析，患病后人體可產(chǎn)生免疫力，但其持續(xù)的時(shí)間較短。

3 臨床癥狀

牛是EHEC O157:H7的主要攜帶者，但成年牛一般不會(huì)發(fā)病，并且沒有臨床癥狀，只有犢牛才會(huì)出現(xiàn)腹瀉癥狀。豬感染該菌后可導(dǎo)致水腫病，以頭部，腸系膜和胃壁漿液性水腫為主要特征，且常伴有共濟(jì)失調(diào)，麻痹或驚厥等神經(jīng)癥狀，發(fā)病率較低但死亡率很高。對(duì)死亡小鼠進(jìn)行剖檢可見整個(gè)腸道腸壁菲薄，透明腫大有氣泡，充血、出血，充滿黃色液體，其中尤其以十二指腸最為嚴(yán)重；肝臟灰白色點(diǎn)狀壞死，周邊淤血；心、肺、脾、腎點(diǎn)狀出血等。

人對(duì)EHEC O157:H7普遍易感。流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)研究表明該病的潛伏期通常為3~4 d，短則1~2 d，長則5~8 d，多數(shù)出血性結(jié)腸炎患者發(fā)病后10 d內(nèi)即可自愈。臨床資料統(tǒng)計(jì)表明，EHEC O157:H7感染患者大多急性發(fā)病，常突然發(fā)生劇烈腹痛和非血性腹瀉，數(shù)天后出現(xiàn)血性腹瀉，低熱或不發(fā)熱。表現(xiàn)為水樣便、粘液便或膿血便，在有的病例中，取得的糞便樣品甚至是“只有血沒有糞渣”，可見出血性腹瀉的程度。

4 檢測方法

EHEC O157:H7感染已成為全球性的公共衛(wèi)生和食品安全問題，對(duì)其進(jìn)行快速、特異的檢測對(duì)于該病的早期診斷及疫情有效控制至關(guān)重要。生物技術(shù)的發(fā)展為EHEC O157:H7的實(shí)驗(yàn)室診斷提供了許多有效的手段和方法。

4.1 細(xì)菌分離法

國內(nèi)有報(bào)道稱可以使用顯色培養(yǎng)基對(duì)EHEC O157:H7進(jìn)行初篩，目前常規(guī)使用山梨醇麥康凱瓊脂培養(yǎng)基（SMAC）對(duì)菌株進(jìn)行分離和篩選，在正常條件下，EHEC O157:H7不能發(fā)酵山梨醇，在SMAC瓊脂上呈現(xiàn)為無色或者灰色菌落，而其他大腸桿菌則呈紅色菌落[7]。但有一些其他血清型的O157和變形菌、毗鄰單胞菌屬、摩根菌屬和愛德華菌屬等革蘭氏陰性菌也不發(fā)酵山梨醇。后又根據(jù)頭孢克肟抑制變形菌，O157型菌株不能發(fā)酵鼠李糖，而60%的山梨醇陰性的其他O157發(fā)酵鼠李糖等而制備了頭孢克肟-鼠李糖-山梨醇麥康凱培養(yǎng)基（cefixime rhamnse sorbitol MaConkey agar CR-SMAC），提高了分離的敏感性。

4.2 血清學(xué)檢測方法

EHEC O157:H7經(jīng)初步分離培養(yǎng)后需要進(jìn)一步通過血清學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行鑒定，目前常用的血清學(xué)診斷方法有玻片凝集試驗(yàn)、乳膠凝集試驗(yàn)和ELISA法等。玻片凝集試驗(yàn)常常出現(xiàn)假陰性的結(jié)果。乳膠凝集試驗(yàn)可以直接從廠家購買乳膠凝集試劑盒按兩步法進(jìn)行檢測，具體步驟為挑取分純的菌株分別與O157、H7診斷血清做凝集試驗(yàn)。凡與O157單克隆抗體凝集達(dá)++以上者，再用H7血清凝集。若H7鞭毛抗原發(fā)育不良，可用0.3%~0.4%半固體瓊脂做U型管誘導(dǎo)鞭毛產(chǎn)生，然后再進(jìn)行凝集，凝集++以上者可初步判定為EHEC O157:H7菌株。目前實(shí)驗(yàn)室最常用的血清學(xué)檢測方法是ELISA法，利用全菌體、LPS和Stx等抗原檢測血清中相應(yīng)的抗體水平。宿主感染EHEC后，一般都會(huì)誘發(fā)抗LPS抗體，所以在血清學(xué)檢測上，一般都是檢測抗LPS的抗體。

4.3 免疫學(xué)檢測方法

4.3.1 免疫磁珠法 基本操作是先將標(biāo)本進(jìn)行選擇性增菌，然后加入EHEC O157:H7抗體包被的磁珠，37℃振搖培養(yǎng)30 min，再用磁板將免疫磁珠沉淀，從而分離得到EHEC O157:H7。

4.3.2 蛋白芯片檢測法 基本操作是首先將抗原（或抗體）固定于膜、載玻片等載體上制成檢測用芯片，然后用該芯片去捕捉待檢樣品中的特異性抗體（或抗原），最后加入熒光標(biāo)記的二抗，經(jīng)激光共聚焦掃描儀或熒光掃描儀掃描，記錄芯片上各點(diǎn)的熒光強(qiáng)度，從而對(duì)樣品進(jìn)行判定。

4.3.3 膠體金免疫層析試紙檢測法 當(dāng)前國內(nèi)外多以雙抗體夾心法檢測樣品中的EHEC O157:H7菌體（O）抗原。用膠體金標(biāo)記抗EHEC O157:H7的單克隆抗體，然后與樣品中的EHEC O157:H7結(jié)合，形成雙抗體夾心結(jié)構(gòu)，呈現(xiàn)出肉眼可見的紅色條帶。該法靈敏度高、特異性強(qiáng)，操作簡便、快速，結(jié)果準(zhǔn)確、易于判讀。

4.4 分子生物學(xué)檢測法

4.4.1 PCR技術(shù) 目前常用的PCR技術(shù)為實(shí)時(shí)熒光定量PCR，該P(yáng)CR法：除具有比常規(guī)PCR更好的特異性和敏感性外，還能對(duì)樣本進(jìn)行定量，準(zhǔn)確反應(yīng)出污染或感染的強(qiáng)度，在病原體檢測中顯示出很強(qiáng)的優(yōu)勢。Karen[8]等在FQ-PCR的基礎(chǔ)上建立了目的基因?yàn)閟tx1、stx2和uidA的檢測EHEC O157:H7多重實(shí)時(shí)熒光PCR方法，敏感性達(dá)到98.6%，特異性100%，具有較好的應(yīng)用前景。

4.4.2 基因芯片技術(shù) 基因芯片技術(shù)又稱為DNA芯片技術(shù)，是近年來分子生物學(xué)及醫(yī)學(xué)診斷技術(shù)的重要進(jìn)展，該技術(shù)能高效大規(guī)模的獲取相關(guān)的生物信息，是一種重要的基因檢測手段。Call等[9]將EHEC O157:H7 編碼 Intimin，Stx1，Stx2 和 HeamolysinA 等4種毒力因子的25~30 mer寡核苷酸探針固定在玻片上，模板DNA可直接與之雜交。與普通凝膠電泳法相比該方法靈敏度提高了30倍，能夠檢測小于1個(gè)細(xì)胞的基因組DNA量的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物（1fg）。

4.4.3 生物傳感器技術(shù) 生物傳感器是將生物芯片和傳感技術(shù)結(jié)合在一起的產(chǎn)物，是現(xiàn)代科技的前沿技術(shù)之一，具有選擇性高、分析速度快、操作簡易和價(jià)格低廉等特點(diǎn)，可以進(jìn)行在線或活體分析。Demarco[10]設(shè)計(jì)制造了一種消散波光纖生物傳感器，利用該生物傳感器分別檢測l0 g和25 g碎牛肉樣品中的細(xì)菌污染情況。結(jié)果顯示l0 g樣品的檢測靈敏度為5.2×102cfu/g，25 g樣品的檢測靈敏度為9.0×103cfu/g，并且在處理樣品的25 min中內(nèi)沒有出現(xiàn)任何假陽性結(jié)果。該方法靈敏、重復(fù)性好，特異性也較為理想。

5 防控策略

近年來世界各地EHEC O157:H7的流行范圍不斷擴(kuò)大，受到世界各國衛(wèi)生組織的高度重視。目前，對(duì)EHEC O157:H7的自然攜帶宿主及該菌引起的感染尚缺乏有效的防治手段，國家衛(wèi)生部規(guī)定EHEC O157:H7感染患者和疑似病人禁止使用抗生素進(jìn)行治療。臨床研究證明，用磺胺類和內(nèi)酰胺類抗生素對(duì)EHEC O157:H7感染患者進(jìn)行治療，會(huì)增加患者并發(fā)HUS的危險(xiǎn)性[11]。因此對(duì)該菌的防控就顯得尤為重要，除消滅傳染源、切斷傳播途徑外，近年來EHEC O157:H7疫苗的研究對(duì)該病的防控也起到了重要的作用。

5.1 消滅傳染源

牛和其他少數(shù)反芻動(dòng)物是EHEC O157:H7的主要的儲(chǔ)存宿主，從豬、鴿、牛、雞、鴨等動(dòng)物中也有分離到EHEC O157:H7的報(bào)道。一些方法已被用于減少該菌在牛腸道中的定居，如調(diào)整飼料配比、應(yīng)用微生態(tài)制劑以及使用噬菌體消滅該菌等。由于該菌引起的感染大多由環(huán)境污染而來，所以對(duì)帶菌動(dòng)物排泄物的處理也十分重要。通過發(fā)酵糞便的方法殺滅EHEC O157:H7，能大大降低其存活數(shù)量。

5.2 切斷傳播途徑

由于人與帶菌動(dòng)物接觸也會(huì)導(dǎo)致EHEC O157:H7的感染，所以農(nóng)場的工作人員及其他與之有接觸的人員應(yīng)采取適當(dāng)?shù)姆雷o(hù)措施，并注意個(gè)人衛(wèi)生，不在飼養(yǎng)動(dòng)物的地方用餐。避免糞便污染水源，保持水源清潔。在食品加工、零售的各個(gè)環(huán)節(jié)要嚴(yán)格遵守食品衛(wèi)生法規(guī)，并要加強(qiáng)對(duì)動(dòng)物性食品的微生物學(xué)檢測。

5.3 免疫預(yù)防

研究表明，EHEC O157:H7被巨噬細(xì)胞吞噬后并不能在短時(shí)間內(nèi)被消滅掉，在這段時(shí)間內(nèi)，Stx在菌體內(nèi)的表達(dá)量反而會(huì)迅速增加，該菌被溶酶體裂解后，產(chǎn)生的Stx又會(huì)被巨噬細(xì)胞釋放出來，同時(shí)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的炎性細(xì)胞因子、IL和TNF等也會(huì)一起被釋放出來，導(dǎo)致病理反應(yīng)的增強(qiáng)[12]。因此，有效的免疫預(yù)防是控制EHEC O157:H7感染的最好策略，其中疫苗接種為免疫預(yù)防的重要手段之一。目前對(duì)EHEC O157:H7疫苗的研究主要集中在多糖結(jié)合疫苗、亞單位疫苗、轉(zhuǎn)基因植物疫苗、細(xì)菌ghost疫苗、減毒活菌苗和重組載體活菌苗等幾個(gè)方面，一些疫苗已取得了重大進(jìn)展，進(jìn)入臨床實(shí)驗(yàn)階段。但EHEC O157:H7疫苗真正應(yīng)用于臨床免疫防治還有待時(shí)日，許多問題有待解決，如篩選最佳抗原或抗原組合、尋找高效、安全的佐劑或研制不需要佐劑的疫苗和建立更接近人體免疫狀況的動(dòng)物模型等。相信經(jīng)過科研人員的不懈努力，用疫苗來防治EHEC O157:H7的感染將變?yōu)楝F(xiàn)實(shí)。

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