劉明明，賈立軍，薛書江，梁晚?xiàng)?，張守發(fā)

（延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)系，吉林延吉 133002）

附紅細(xì)胞體?。‥perythrozoonsis）是由附紅細(xì)胞體（Eperythrozoon）寄生于紅細(xì)胞表面、血漿及骨髓中引起的一種以高熱、貧血、黃膽等為主要臨床特征的人畜共患病[1-3]。豬、牛、羊、馬、犬、貓、雞和鼠等多種動(dòng)物及人均可感染發(fā)病，其中以豬附紅細(xì)胞體病最為嚴(yán)重[4]。不同品系、性別和年齡的豬均可感染附紅細(xì)胞體病，四季均有發(fā)生，以夏秋兩季更易發(fā)病。該病多以隱性感染為主，在從未感染過的地區(qū)則常出現(xiàn)嚴(yán)重的地方性流行和暴發(fā)，不僅給畜牧業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失，還嚴(yán)重影響人類的身心健康[5]。本試驗(yàn)應(yīng)用PCR方法對(duì)2009—2011年間采自吉林省延邊地區(qū)的237頭份豬血液樣本進(jìn)行了豬附紅細(xì)胞體病流行病學(xué)調(diào)查，旨在為延邊地區(qū)豬附紅細(xì)胞體病提供科學(xué)的流行病學(xué)資料，以便有效控制該病的流行與發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣本來源

237份豬血液樣本采自吉林省延邊地區(qū)延吉、和龍、圖們、琿春及龍井等5個(gè)縣市，頸靜脈無菌采集抗凝血，-20℃保存，備用。

1.1.2 主要試劑

rTaq DNA 聚合酶、DNA Marker、DNA 提取試劑盒等均購(gòu)自大連寶生物工程有限公司；其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純級(jí)產(chǎn)品。

1.1.3 引物的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank中登錄的豬附紅細(xì)胞體膜蛋白OxaA 序列（CBZ40902.1），應(yīng)用 Primer Premier 5.0和Oligo 6.0軟件設(shè)計(jì)引物，上游引物 P1：5'-TCTTATGTCTTTGTTGTAAATCTG-3'；下游引物 P2：5'-TTTTCAATCTATGTTCACCTCA-3'。擴(kuò)增片段大小386 bp；對(duì)照用引物的靶基因?yàn)?6 S rRNA，上游引物 P1：5'-CGAAAGTCTGATGGAGCAATAC-3'；下游引物 P2：5'-AACCAAACATCTCAAGACACGA-3'，擴(kuò)增片段大小703 bp。引物均由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 PCR檢測(cè)

將采集的237份豬血液樣本，應(yīng)用DNA提取試劑盒提取基因組DNA，以基因組DNA為模板，以膜蛋白OxaA為靶基因的PCR擴(kuò)增體系為25μL：10×Bufer 2.5 μL，dNTP 2 μL，rTaq DNA Polymerase 0.3μL，引物（10 pmol／L）各 1.5μL，DNA 模板 2 μL。優(yōu)化后的擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5 min；94℃變性45s，57℃退火 45s，72℃延伸 45s，共 30 個(gè)循環(huán)；72℃延伸7 min，4℃結(jié)束反應(yīng)。同時(shí)進(jìn)行16 S rRNA靶基因的PCR擴(kuò)增[6]。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果。

1.2.2 檢測(cè)結(jié)果的比較

應(yīng)用敏感性最好的靶基因PCR方法對(duì)吉林省延邊地區(qū)5個(gè)縣市采集的237份豬血液樣本，進(jìn)行不同地區(qū)、不同年齡段、不同季節(jié)及不同飼養(yǎng)方式的豬附紅細(xì)胞體感染情況的比較。

2 結(jié)果

2.1 兩種不同靶基因引物的PCR檢測(cè)結(jié)果

以豬附紅細(xì)胞體膜蛋白OxaA序列（CBZ40902.1）設(shè)計(jì)引物建立的PCR方法對(duì)采集的237份豬血液樣本進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)與16 S rRNA設(shè)計(jì)引物的PCR方法進(jìn)行比較。結(jié)果表明，以膜蛋白OxaA為靶基因的PCR方法較16 S rRNA為靶基因的PCR方法陽性檢出率高，結(jié)果見表1。故選擇膜蛋白OxaA為靶基因的PCR方法作為此次流行病學(xué)調(diào)查的最佳方法（見表1）。

表1 兩種不同靶基因引物的PCR檢測(cè)結(jié)果比較

2.2 不同地區(qū)豬附紅細(xì)胞體感染情況PCR檢測(cè)結(jié)果

以靶基因膜蛋白OxaA為引物的PCR為準(zhǔn)，對(duì)237份采自延吉、和龍、圖們、琿春和龍井5個(gè)縣市的血液樣本進(jìn)行PCR檢測(cè)，結(jié)果見表2。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，各縣市豬附紅細(xì)胞體感染率差異不顯著（P＞0.05）（見表 2）。

表2 不同地區(qū)豬附紅細(xì)胞體感染情況比較

2.3 不同年齡豬感染附紅細(xì)胞體情況PCR檢測(cè)結(jié)果

以靶基因膜蛋白OxaA為引物的PCR為準(zhǔn)，對(duì)237份不同年齡的種母豬、育肥豬、斷奶仔豬和哺乳仔豬的血液樣本進(jìn)行PCR檢測(cè)，感染情況見表3。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，不同年齡豬感染附紅細(xì)胞體陽性率差異不顯著（P＞0.05）（見表 3）。

表3 不同年齡豬感染附紅細(xì)胞體情況比較

2.4 不同季節(jié)豬感染附紅細(xì)胞體情況PCR檢測(cè)結(jié)果

以靶基因膜蛋白OxaA的引物為準(zhǔn)，對(duì)237份采自不同季節(jié)的血液樣本進(jìn)行PCR檢測(cè)，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，夏秋兩季豬附紅細(xì)胞體陽性率顯著高于冬春兩季（P＜0.05）（見表 4）。

表4 不同季節(jié)豬感染附紅細(xì)胞體情況比較

2.5 不同飼養(yǎng)方式豬感染附紅細(xì)胞體情況PCR檢測(cè)結(jié)果

以靶基因膜蛋白OxaA的引物為準(zhǔn)，對(duì)237份采自不同飼養(yǎng)方式的血液樣本進(jìn)行PCR檢測(cè)，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，農(nóng)戶飼養(yǎng)方式豬附紅細(xì)胞體陽性率顯著高于規(guī)模化養(yǎng)殖方式（P＜0.01）（見表5）。

表5 不同飼養(yǎng)方式豬感染附紅細(xì)胞體情況比較

2.6 部分臨床樣本的PCR檢測(cè)結(jié)果

以靶基因膜蛋白OxaA的引物為準(zhǔn)，對(duì)237份血液樣本進(jìn)行PCR檢測(cè)，部分臨床樣本PCR檢測(cè)結(jié)果見圖1。

3 討論

附紅細(xì)胞體為條件性致病微生物，當(dāng)動(dòng)物機(jī)體免疫力下降或感染其它病原時(shí)，附紅細(xì)胞體在血液中就會(huì)大量增殖，繼發(fā)引起各種疾病的交叉感染，導(dǎo)致動(dòng)物死亡，極大影響了畜牧業(yè)健康發(fā)展[7-8]。本次調(diào)查采用了PCR方法對(duì)吉林省延邊地區(qū)237頭份豬血液樣本進(jìn)行檢測(cè)，并事先對(duì)兩種不同靶基因的引物進(jìn)行比較，排除假陰性樣本的干擾，以便更為準(zhǔn)確的檢測(cè)出豬附紅細(xì)胞體病。

本次調(diào)查對(duì)檢測(cè)的237頭份豬血液樣本按不同地區(qū)、年齡、季節(jié)及飼養(yǎng)方式的感染情況分別進(jìn)行了比較，結(jié)果表明豬附紅細(xì)胞體的感染與季節(jié)和飼養(yǎng)方式的關(guān)系較密切，受地區(qū)和年齡影響較小。

調(diào)查結(jié)果顯示，吉林省延邊地區(qū)在2009—2011年間豬附紅細(xì)胞體的平均感染率為23.6%，這與2008年李月梅等對(duì)吉林省豬附紅細(xì)胞體感染率的調(diào)查相比有明顯的下降[9]，但與國(guó)外研究結(jié)果顯示的附紅細(xì)胞體在豬群中的患病率約為10%~15%相比還是偏高[10]。因此，附紅細(xì)胞體病作為養(yǎng)豬業(yè)的潛在威脅，其危害不容忽視。鑒于目前附紅細(xì)胞體病的研究現(xiàn)狀，對(duì)豬附紅細(xì)胞體病的防治研究仍是一項(xiàng)艱巨任務(wù)。

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