鄭 喆

(遼寧省沈陽市第四人民醫(yī)院血液內(nèi)科，遼寧 沈陽 110031)

1 病例與方法

1.1 病例來源

2004年4月至2010年8月在沈陽市第四人民醫(yī)院內(nèi)科血液系門診就診、住院的急性淋巴細(xì)胞白血?。ˋLL）患者40例，其中：男26例，女14例，中位年齡：25歲。對所有患者均按FAB分型診斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行確診。并以確診為缺鐵性貧血25例、巨幼細(xì)胞性貧血15例，作為對照組患者40例，其中男21例，女19例，中位年齡39歲。

1.2 分組

根據(jù)急性淋巴細(xì)胞白血病患者就診時的血Rt，WBC計(jì)數(shù)是否高于20×109/L來分組：①高白細(xì)胞組：WBC＞20×109/L，有24例；②低細(xì)胞組：WBC＜20×109/L，有16例。③對照組：確診為單純性貧血的患者，無WBC計(jì)數(shù)升高或降低，共40例。按急性淋巴細(xì)胞白血病的就診狀態(tài)來分組：初診組5例，完全緩解組6例，復(fù)發(fā)組29例。

1.3 檢測方法

1.3.1 測定p16蛋白表達(dá)值

對40例急性淋巴細(xì)胞白血病患者做骨穿，采集其少許骨髓樣本。采用APAAP方法檢測：用淋巴細(xì)胞分離液分離出單個的淋巴細(xì)胞，用1640液洗滌，制成細(xì)胞懸液，滴片后放入-20℃的冰箱里保存，備用。（對40例確診為單純性貧血的患者做骨穿時另外留取少許骨髓樣本，也做這個測定，作為對照組）。用博士德生物制品公司生產(chǎn)的免疫組化試劑盒來做免疫組化檢測，記錄結(jié)果。

1.3.2 p16蛋白表達(dá)是否缺失的檢測標(biāo)準(zhǔn)

當(dāng)受檢淋巴細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)較多的棕色顆粒，即：該棕色顆粒占細(xì)胞內(nèi)所有顆粒的25%以上時，則為陽性表達(dá)——不缺失，（正常）。當(dāng)受檢淋巴細(xì)胞內(nèi)的棕色顆粒較少，即：棕色顆粒占細(xì)胞內(nèi)所有顆粒的25%以下時，則為陰性表達(dá)——低表達(dá)；表達(dá)缺失，（異常）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

1.5 研究設(shè)計(jì)類型

該調(diào)查設(shè)計(jì)屬于回顧性調(diào)查研究類型；實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)屬于成組設(shè)計(jì)類型。

2 結(jié) 果

2.1 對照組和ALL不同病期患者的p16蛋白表達(dá)缺失值不同

①對照組：單純性貧血者40例，他們的p16蛋白表達(dá)值，均為陽性表達(dá)；②急性淋巴細(xì)胞白血病（ALL）不同病期患者組40例患者的p16蛋白表達(dá)值，均為陰性表達(dá)，其中，初診組患者的p16蛋白表達(dá)缺失值為10%～21%，復(fù)發(fā)組患者的p16蛋白表達(dá)缺失值為2%～5%，完全緩解組患者的該值為19%～25%，并且，ALL初診組、復(fù)發(fā)組的p16蛋白表達(dá)缺失值顯著低于對照組、完全緩解組的p16蛋白表達(dá)缺失值，（P＜0.01）；ALL完全緩解組的p16蛋白表達(dá)值與對照組的陽性表達(dá)值的差異無顯著性（P＞0.05）。

2.2 動態(tài)檢測15例ALL患者的p16蛋白表達(dá)缺失值

檢測、觀察15例ALL患者從緩解期到復(fù)發(fā)期的演變過程中的p16蛋白表達(dá)缺失值的變化，發(fā)現(xiàn)他們的p16蛋白表達(dá)缺失值在26.8%～4.3%之間，很明顯，ALL復(fù)發(fā)期的p16蛋白表達(dá)缺失值低于ALL完全緩解期的p16蛋白表達(dá)缺失值，（P＜0.01）。在骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)確診15例ALL患者復(fù)發(fā)之前1個月時的p16蛋白表達(dá)缺失值就都顯著低于其在完全緩解期時的該指標(biāo)了。直到臨床醫(yī)師確診其復(fù)發(fā)時，此p16蛋白表達(dá)缺失值已達(dá)高峰值。

2.3 初診、ALL復(fù)發(fā)未治組患者部分臨床特征與p16蛋白表達(dá)缺失值之間的關(guān)系

①WBC＞20×109/L組的p16蛋白缺失值低于WBC＜20×109/L組的p16蛋白缺失值；②肝脾腫大組的p16蛋白缺失值也明顯低于無肝脾腫大組的p16蛋白缺失值。因P＜0.05，故其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示：WBC＞20×109/L組、肝脾腫大組患者的p16蛋白缺失值均顯著降低。

3 討 論

急性淋巴細(xì)胞白血?。ˋLL）是惡性淋巴細(xì)胞在骨髓、外周血和其他器官克隆性增殖的一種異質(zhì)性疾病，占急性白血病發(fā)病率的30%～40%[1]。

近年來，隨著血液病臨床醫(yī)學(xué)的發(fā)展，使得急性淋巴細(xì)胞白血病的基因?qū)W理論與臨床研究理論相結(jié)合的水平得到提高。

人們發(fā)現(xiàn)：p16蛋白來自p16基因，p16基因是一種新型的重要的抑癌基因，它位于細(xì)胞核染色體的9P21的位置上，是細(xì)胞核G1/S期相互轉(zhuǎn)換的關(guān)鍵性的調(diào)控基因。在正常人體組織中，p16基因可以使人體骨髓產(chǎn)生p16蛋白，這種蛋白可以抑制細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）4和6的作用，該基因可以競爭細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）4和6的（即CDKS）的活性，可以直接抑制細(xì)胞增殖[2]。測定在骨髓的正常狀態(tài)——p16抑癌基因沒有失活的情況下的 p16蛋白表達(dá)值，其正常值應(yīng)為陽性表達(dá)值。

而急性淋巴細(xì)胞白血病者和急性淋巴細(xì)胞白血病復(fù)發(fā)患者，其p16基因發(fā)生突變，使p16抑癌基因失活，迫使淋巴細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞核p16基因轉(zhuǎn)錄、翻譯等調(diào)控機(jī)制失活，引起骨髓內(nèi)的淋巴系造血干細(xì)胞的核染色體的細(xì)胞分裂周期加速，使G1期縮短，特別是在DNA還沒有修復(fù)之前就使核染色體的細(xì)胞分裂過早地進(jìn)入S期，導(dǎo)致p16第1外顯子和（或）第2外顯子甲基化[3]。這種甲基化重復(fù)發(fā)生，即過度甲基化，就勢必引起骨髓內(nèi)的淋巴造血干細(xì)胞p16基因競爭性抑制細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶4和6（CDKS）的作用，使得抑制細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）4和6的功能衰減，從而引發(fā)p16抑癌基因蛋白缺失，因此，使p16抑癌基因不能直接抑制骨髓內(nèi)的淋巴造血干細(xì)胞的增殖，導(dǎo)致癌性淋巴細(xì)胞過度增生——增殖失控。這就是為什么使急性淋巴細(xì)胞白血病患者骨髓不能產(chǎn)生這種p16蛋白，使在臨床上測定p16蛋白表達(dá)缺失值時，常常表現(xiàn)為低表達(dá)或表達(dá)缺失（陰性表達(dá)）的根本病因機(jī)制所在，這可能就是淋巴細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化（克?。┑年P(guān)鍵。p16抑癌基因失活和p16抑癌基因蛋白表達(dá)缺失，必將導(dǎo)致ALL患者骨髓液p16蛋白表達(dá)為低表達(dá)或表達(dá)缺失，即導(dǎo)致急性淋巴細(xì)胞白血病的復(fù)發(fā)。

人體內(nèi)p16抑癌基因失活能夠引發(fā)p16蛋白表達(dá)缺失，這一機(jī)制在急性淋巴細(xì)胞白血?。ˋLL）復(fù)發(fā)機(jī)制中起著重要的作用。一些研究證明：慢性粒細(xì)胞白血病（CML）在發(fā)生急淋變的前3個月時間里就已發(fā)生p16抑癌基因失活，如果在這個期間里為其檢測p16蛋白表達(dá)值，它則顯示為表達(dá)缺失，表示該患已經(jīng)發(fā)生急淋變。即通過測定p16蛋白表達(dá)值，就可以預(yù)測慢性粒細(xì)胞白血病患者是否已發(fā)生急淋變[4]。聯(lián)合檢測不同標(biāo)本的p16基因甲基化，可以提高肺癌診斷的敏感性[5]。

檢測急性淋巴細(xì)胞白血病患者的p16蛋白表達(dá)值就是檢測其體內(nèi)p16抑癌基因過度甲基化的程度，從而可以檢測到該患病程是否已進(jìn)入到復(fù)發(fā)階段。

上述臨床研究表明：對照組和ALL不同病期患者p16蛋白表達(dá)（缺失）值不同；急性淋巴細(xì)胞白血?。ˋLL）不同病期患者組的p16蛋白表達(dá)值，均為陰性表達(dá)；動態(tài)檢測15例ALL患者的p16蛋白缺失值，發(fā)現(xiàn)ALL復(fù)發(fā)期的p16蛋白表達(dá)缺失值顯著低于ALL完全緩解期的該值；WBC＞20×109/L組、肝脾腫大組患者的p16蛋白缺失值均顯著降低。而確診為單純性貧血患者的p16蛋白表達(dá)值，均為陽性表達(dá)。

對ALL完全緩解后患者進(jìn)行動態(tài)監(jiān)測p16蛋白表達(dá)缺失值；動態(tài)做血Rt檢查，觀察WBC計(jì)數(shù)是否其高于20×109/L、WBC分類中淋巴細(xì)胞百分比值、絕對值是否異常升高，來輔助判斷其病情的輕重。通過動態(tài)測定ALL患者p16蛋白表達(dá)值、血Rt這兩項(xiàng)結(jié)果，進(jìn)行觀察分析，則將十分有利于醫(yī)師盡早地判斷急性淋巴細(xì)胞白血病患者是否已經(jīng)復(fù)發(fā)、是否具有復(fù)發(fā)趨勢，做出確定診斷，以便使醫(yī)師能及時地對其采取有效的治療措施，挽救其生命。同時，因?yàn)檫@兩項(xiàng)檢查易于被患者接受，故其具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。

在新推薦的診斷標(biāo)準(zhǔn)中，檢測真性紅細(xì)胞增多癥（簡稱“真紅”）高發(fā)JAK2基因突變，已被當(dāng)作“真紅”診斷的一個重要指標(biāo)。更有人建議真性紅細(xì)胞增多癥高發(fā)JAK2基因突變方面的檢測，可作為篩選真紅的重要方法，從而不需要進(jìn)一步做骨髓活檢和血液學(xué)參數(shù)等項(xiàng)檢查了[6]。而急性淋巴細(xì)胞白血病是比“真紅”更厲害的惡性克隆性造血干細(xì)胞疾病，因此，對急性淋巴細(xì)胞白血病患者開展測定p16蛋白表達(dá)值是否缺失或者低下，也可作為篩選急性淋巴細(xì)胞白血病是否復(fù)發(fā)的重要方法。

在血液內(nèi)科臨床實(shí)踐中，醫(yī)師對白血病，尤其是對急性白血病患者應(yīng)當(dāng)持續(xù)地開展p16蛋白表達(dá)缺失值和血Rt的聯(lián)合檢測，這對醫(yī)師及時地診斷患者是否為急性淋巴細(xì)胞白血病、盡早確診某急性淋巴細(xì)胞白血病患者是否已經(jīng)復(fù)發(fā)；（慢粒白血病是否已發(fā)生急淋變），都必將起著舉足輕重的作用。

[1] 顧敏,李艷,秘營昌,等.Ph染色體陽性急性白血病38例臨床分析[J].中國實(shí)用內(nèi)科雜志,2009,29(7)：641.

[2] Tutor O,Diaz MA,Ramirez M,et al.Loss of heterozygosity of p16 correlates with minimal residual disease at the end of the induction therapy in non-high risk childhood B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia[J].Leuk Res,2007,26(9)：817-820.

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[4] 許多榮,洪文德,童秀珍,等.P16基因異常與慢性粒細(xì)胞白血病關(guān)系的研究[J].中華血液學(xué)雜志,1999,20(11)：602-603.

[5] 胡灼君,劉大鷹,胡宏波,等.P16基因甲基化聯(lián)合檢測在肺癌診斷中的意義[J].中國實(shí)用內(nèi)科雜志,2009,29(1)：50-52.

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