楊武晨，郭 紅

幽門(mén)螺桿菌（Helicobacterpylori，H.pylori）是一種定植在人胃和十二指腸的微需氧、革蘭氏陰性、螺旋彎曲菌。H.pylori是上消化道的主要致病菌，與胃炎、消化性潰瘍、胃粘膜相關(guān)淋巴組織淋巴瘤（MALT）和胃癌等疾病的發(fā)生密切相關(guān)。近幾年的研究顯示，H.pylori感染還與缺血性心臟病、動(dòng)脈粥樣硬化、缺鐵性貧血等胃外疾病相關(guān)［1］。尿素酶是H.pylori中含量最為豐富的蛋白，占H.pylori可溶性蛋白的5%～10%，結(jié)構(gòu)亞單位為尿素酶A和尿素酶B。其中，尿素酶B亞單位（Urease subunit beta，UreB）為尿素酶的活性亞基，在幽門(mén)螺桿菌的致病過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用，相對(duì)分子質(zhì)量較大，約為64 000，具有高度的保守性和免疫原性，是H.pylori最佳的疫苗候選抗原之一。

1 幽門(mén)螺桿菌疫苗研究概論

H.pylori是人類(lèi)上消化道疾病的重要致病菌。1994年，世界衛(wèi)生組織已將其列為人群第一類(lèi)致癌因子［2］。目前，臨床上主要是通過(guò)“三聯(lián)”或“四聯(lián)”療法來(lái)對(duì)H.pylori感染的患者進(jìn)行根除治療，但因藥物的副作用大，患者的依從性差，耐藥菌株的逐漸增加，使其應(yīng)用受到了較大的限制。且根除治療并不能預(yù)防H.pylori的感染與根除后再感染。幽門(mén)螺桿菌疫苗能誘發(fā)機(jī)體的特異性免疫應(yīng)答清除感染，又可激發(fā)機(jī)體的免疫記憶來(lái)預(yù)防再次感染，且副作用少。因此，自從幽門(mén)螺桿菌被發(fā)現(xiàn)之后人們便廣泛開(kāi)展其疫苗的研究［3］?，F(xiàn)有疫苗主要有以下幾種形式：

①全菌滅活疫苗——較為傳統(tǒng)的疫苗 其抗原成分較為復(fù)雜，包含了H.pylori的所有抗原成分，可以誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生高效的免疫應(yīng)答。但是，特異性不高、副作用較大、易發(fā)生交叉免疫反應(yīng)，不適用于人體接種，具有一定的局限性。

②亞單位疫苗——疫苗研究的重點(diǎn) 其抗原成分具有較全菌疫苗的簡(jiǎn)單、成分清楚、安全性好、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。常見(jiàn)的亞單位疫苗的抗原主要包括：尿素酶及其B亞單位（UreB）、細(xì)胞毒素相關(guān)蛋白A（Cag A）、粘附素（Hpa A）、熱休克蛋白（HSP）、空泡毒素（Vac A）、脂多糖（LPS）等。目前，UreB作為抗原的疫苗研究較多。

③聯(lián)合疫苗/多價(jià)疫苗——兩種或多種抗原成分 使用單價(jià)疫苗存在著一定局限性，為了克服單種抗原免疫原性弱、免疫效果不強(qiáng)等缺點(diǎn)，聯(lián)合疫苗/多價(jià)疫苗可獲得比單價(jià)疫苗較好的免疫保護(hù)效果，能明顯提高動(dòng)物的免疫保護(hù)率。

④核酸疫苗——第三代疫苗 較常規(guī)疫苗相比具有生產(chǎn)制備簡(jiǎn)便、高效、廣譜、廉價(jià)、無(wú)致病性、易存儲(chǔ)以及能激發(fā)機(jī)體細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答等優(yōu)點(diǎn)。

⑤表位疫苗——疫苗發(fā)展的新方向 機(jī)體的免疫應(yīng)答不是針對(duì)整個(gè)外源物質(zhì)（抗原），而僅僅只是抗原的一小段區(qū)域，即抗原表位。表位疫苗，就是使用抗原表位制備而成的疫苗。根據(jù)抗原表位的不同，分為B細(xì)胞表位疫苗、T細(xì)胞表位疫苗和兼具有2種表位的多表位疫苗［4］。目前，UreB的B細(xì)胞表位和Th細(xì)胞表位鑒定已有文獻(xiàn)報(bào)道［5－6］。表位疫苗具有易于生產(chǎn)、特異性高、免疫原性強(qiáng)、安全性較好等特點(diǎn)。表位疫苗，是近年來(lái)疫苗設(shè)計(jì)的新思路，具較好的應(yīng)用前景。

2 尿素酶B亞單位的主要特性

無(wú)論疫苗是什么形式，其核心仍是組成疫苗的抗原成分。尿素酶B亞單位之所以能夠成為研究最為廣泛的幽門(mén)螺桿菌疫苗抗原，與其特性密不可分。H.pylori中尿素酶是含量最為豐富的蛋白，占H.pylori可溶性蛋白的5%～10%，是H.pylori重要的定植因子和毒力因子。尿素酶是一種含有Ni離子的金屬酶，活性部位的鎳離子含量決定尿素酶的活性。其由A、B 2個(gè)結(jié)構(gòu)亞單位和輔助蛋白組成［7］。Ure A與UreB結(jié)構(gòu)蛋白，主要功能是通過(guò)水解尿素生成氨和二氧化碳來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)外或/和周質(zhì)的p H值，保護(hù)H.pylori抵抗胃酸的作用，促使菌體定植于胃黏膜，在菌體致病過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。

UreB缺乏尿素酶的全酶活性，具有無(wú)毒性和較高的免疫原性，能有效誘導(dǎo)機(jī)體的免疫保護(hù)作用，相對(duì)分子質(zhì)量較大，約為64 000。不同H.pylori菌株間UreB核酸序列有高度的同源性，高度保守，用UreB作為免疫原具有較高的穩(wěn)定性。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，UreB比尿素酶的另一結(jié)構(gòu)亞單位Ure A具有較好的免疫保護(hù)性。目前，大量的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明尿素酶B亞單位具有免疫預(yù)防和免疫治療的作用，安全性和有效性進(jìn)一步得到了驗(yàn)證。尿素酶B亞單位是H.pylori的主要特異性抗原，直接從H.pylori菌株中分離UreB的量少，而通過(guò)基因重組技術(shù)來(lái)制備大量的UreB，為建立特異性的UreB疫苗奠定基礎(chǔ)。因此，常把尿素酶B亞單位作為疫苗設(shè)計(jì)的最佳候選抗原。

3 尿素酶B亞單位的疫苗研究進(jìn)展

3.1 UreB的亞單位疫苗/多價(jià)疫苗 過(guò)氧化氫酶和尿素酶B亞單位加免疫佐劑組成的二價(jià)口服疫苗較單價(jià)口服疫苗有更好的預(yù)防C57BL/6小鼠感染人類(lèi)幽門(mén)螺桿菌（H.pylori）的作用，保護(hù)免疫率達(dá)到83.3%（20/24）［8］。李明峰等［9］構(gòu)建表達(dá)了幽門(mén)螺桿菌的熱休克蛋白A亞單位（Hsp A）和尿素酶B亞單位（UreB）的重組蛋白質(zhì)的侯選菌株。融合蛋白免疫BALB/c小鼠，結(jié)果觀察到，免疫的小鼠血清中均可檢測(cè)到抗Hsp A和UreB的抗體，而對(duì)照組則無(wú)相應(yīng)抗體。Hsp A－UreB融合蛋白有可能作為一種有效的雙價(jià)候選疫苗用于幽門(mén)螺桿菌感染的預(yù)防和治療。UreB和Hpa A雙價(jià)重組疫苗聯(lián)用，并輔以佐劑r LTB時(shí)對(duì)小鼠具有較高的免疫保護(hù)率［10］。二價(jià)或多價(jià)疫苗較單價(jià)疫苗的免疫效果強(qiáng)。無(wú)論是以UreB蛋白為抗原的亞單位疫苗還是與其他亞單位抗原聯(lián)合的多價(jià)疫苗，雖然都具有一定的免疫保護(hù)效果。但是，可能存在：①抗原成分復(fù)雜，特異性不高。②免疫佐劑對(duì)人體健康造成危害等問(wèn)題。這就要求人們尋找更為安全有效的疫苗。3.2 UreB的核酸疫苗 曾韋錕等［11］、徐燦等［12］都從不同的H.pylori菌株中成功構(gòu)建了幽門(mén)螺桿菌UreB核酸疫苗，但是都沒(méi)有進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)去驗(yàn)證其免疫原性。袁小澎等［13］擴(kuò)增了幽門(mén)螺桿菌2個(gè)保護(hù)性亞單位UreB、Hsp A基因，進(jìn)行基因融合，成功構(gòu)建了H.pylori雙價(jià)DNA疫苗，免疫小鼠后能夠產(chǎn)生特異性抗體，顯示出良好的免疫原性。劉秀麗等［14］將H.pylori的 UreB－Hsp A融合基因成功構(gòu)建到腺病毒載體上，免疫小鼠3次，在第2次加強(qiáng)免疫后7 d、3次免疫后的14 d，血清抗UreB－Hsp A的IgG抗體滴度基本保持在2次免疫時(shí)的水平，抗體效價(jià)最高可達(dá)1∶2 000，新鮮糞便檢測(cè)sIg A，顯示產(chǎn)生了特異性抗體黏膜sIg A，說(shuō)明重組病毒能夠激發(fā)機(jī)體UreB－Hsp A的特異性體液免疫和黏膜抗體免疫反應(yīng)。但是，融合基因表達(dá)的蛋白較大，特異性不高，免疫原性不強(qiáng)。

3.3 UreB的表位疫苗 國(guó)內(nèi)外關(guān)于UreB的表位疫苗研究取得了一定的進(jìn)展。UreB蛋白含有569個(gè)編碼氨基酸，使用全長(zhǎng)蛋白作為疫苗研究的抗原，存在抗原表位組成成分復(fù)雜、特異性不高、免疫應(yīng)答不強(qiáng)等局限性。如果能找到激發(fā)機(jī)體免疫應(yīng)答的免疫保護(hù)性?xún)?yōu)勢(shì)表位，即用UreB的小片段蛋白，來(lái)替代全長(zhǎng)的UreB在疫苗中發(fā)揮作用，制備高效、特異性的表位疫苗，能激發(fā)機(jī)體較強(qiáng)的免疫應(yīng)答，從而達(dá)到預(yù)防和根除H.pylori的感染。

目前得到的UreB表位大部分是B細(xì)胞表位。Qiu Y等［15］確定UreB的線性表位，3個(gè)B細(xì)胞線性表位的覆蓋了15個(gè)氨基酸（AA）氨基酸區(qū)域在158－172，181－195和 UreB的349－363。肽與谷胱甘肽S－轉(zhuǎn)移酶（GST）融合免疫小鼠，顯示抗原表位肽特異性抗體能抑制尿素酶活性。在臨床應(yīng)用價(jià)值較大，這些肽作為抗原表位疫苗來(lái)治療H.pylori具有重要的意義。Li HX等［16］使用截短法分段構(gòu)建含UreB抗原的重組質(zhì)粒，用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白，對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行鑒定。初步確定抗幽門(mén)螺桿菌尿素酶B亞單位（UreB）單克隆抗體（m Ab）6E6識(shí)別的抗原表位位于200－230位氨基酸。但是抗體在H.pylori感染的免疫保護(hù)中的作用是非必需的還是必需的目前還不確定，有研究也表明清除H.pylori感染的過(guò)程中抗體仍然具有一定的免疫保護(hù)作用。特別是抗體具有中和尿素酶的活性對(duì)于免疫保護(hù)是有利的。

研究顯示，H.pylori的免疫保護(hù)機(jī)制趨向于依賴(lài)CD4＋T細(xì)胞，而并非CD8＋T細(xì)胞的免疫反應(yīng)。幽門(mén)螺桿菌表位疫苗設(shè)計(jì)前提是篩選輔助性T細(xì)胞（helper T lymphocyte，Th）表位，明確各表位激發(fā)的免疫應(yīng)答特性。Shi Y等［5］通過(guò)使用RANKPEP預(yù)測(cè)獲得7條可能的H－2d限制性的Th細(xì)胞表位，其中 3 條表位肽 U546－561，U119－244，和U237－251能夠刺激r UreB致敏的 BALB/c（H－2d）小鼠的CD4＋T淋巴細(xì)胞的增殖。U546－561和U229－244能誘導(dǎo)Th2類(lèi)型的細(xì)胞因子分泌。然而，U237－251能誘導(dǎo)Th1類(lèi)型的細(xì)胞因子分泌。實(shí)驗(yàn)證明，這些免疫優(yōu)勢(shì)表位能刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性的免疫應(yīng)答，應(yīng)用于相應(yīng)的表位疫苗研究能取得較好的免疫保護(hù)效應(yīng)。

為了避免抗原結(jié)構(gòu)中可能存在的抑制性、致病性以及非必需表位的影響，合理組合設(shè)計(jì)具有保護(hù)性B細(xì)胞和Th細(xì)胞表位的多表位疫苗，能夠激發(fā)機(jī)體較強(qiáng)的特異性免疫應(yīng)答。Zhou WY等［17］已經(jīng)設(shè)計(jì)和構(gòu)建了一個(gè)多表位疫苗（命名為 HUepi－LTB），包括作者前期蛋白鑒定的UreB 3個(gè)新的H－2d限制性Th表位（U546－561，U229－244，和 U237－251）、尿素酶的一個(gè) B細(xì)胞表位 U327－334、Hpa A的一個(gè)B細(xì)胞表位（H132－141）和粘膜佐劑大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞單位（LTB）。相對(duì)于口服PBS免疫組，多表位疫苗能顯著的降低H.pylori的定植作用，并且能產(chǎn)生抗原特異性CD4＋T細(xì)胞的應(yīng)答和IgG和粘膜Ig A抗體的產(chǎn)生。

無(wú)論是哪種免疫保護(hù)機(jī)制，是核酸疫苗、亞單位疫苗還是表位疫苗，都具有各自的缺點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)，其最終目的都是能夠引起機(jī)體的細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答，發(fā)展更為簡(jiǎn)便、安全和有效的疫苗，治療和預(yù)防H.pylori的感染。然而在實(shí)現(xiàn)全面、徹底、高效、預(yù)防、治療和根除H.pylori的感染和再感染方面，UreB表位疫苗則具有較好的開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景。

4 展 望

隨著人們對(duì)UreB疫苗研究的不斷深入，使用UreB疫苗來(lái)根治和預(yù)防H.pylori的感染將有可能得到實(shí)現(xiàn)。UreB疫苗具有在菌體中含量豐富、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)；缺乏天然的蛋白天然結(jié)構(gòu)、容易引起免疫耐受、常用的佐劑可能存在潛在的毒性作用等缺點(diǎn)。然而，抗原通過(guò)氨基酸修飾、多表位串連展示到有效載體上，能提高其與抗體的親和力，增強(qiáng)抗原的免疫原性和穩(wěn)定性。

表位疫苗作為未來(lái)疫苗的發(fā)展趨勢(shì)，具有很多的優(yōu)點(diǎn)。如：相對(duì)于亞單位疫苗的成分簡(jiǎn)單；相對(duì)核酸疫苗不存在潛在的威脅；特異性較其他疫苗高。表位的成功篩選和鑒定方法已經(jīng)得到廣泛的應(yīng)用。從已報(bào)道的文獻(xiàn)來(lái)看，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果令一些對(duì)表位疫苗感興趣的學(xué)者欣喜［18］。但是，表位疫苗的研究仍然面臨多方面的考驗(yàn)：如何選擇有效的方法，篩選和鑒定有效的抗原表位成分，以此來(lái)作為疫苗的候選抗原，產(chǎn)生大量特異性抗體和淋巴細(xì)胞，提高其免疫反應(yīng)性；如何選擇有效的載體分子；目前表位研究主要是在實(shí)驗(yàn)小鼠上得到驗(yàn)證，基于人的表位疫苗研究如何；表位疫苗在多種HLA中的限制性，在人群中的作用規(guī)律如何等等，都是人們?cè)谝院蟮难芯恐斜仨毴リP(guān)注的內(nèi)容。研究UreB表位，特別是優(yōu)勢(shì)表位，對(duì)揭示UreB的有效作用成分、闡明H.pylori疫苗的作用機(jī)理，對(duì)發(fā)展更安全有效的H.pylori疫苗具有理論指導(dǎo)意義。

［1］Goodman K J，Joyce S L，Ismond K P.Extragastric diseases associated withHelicobacterpyloriinfection［J］.Curr Gastroenterol Rep，2006，8（6）：458－464.

［2］Polk DB，Peek RM Jr.Helicobacterpylori：gastric cancer and beyond［J］.Nat Rev Cancer，2010，10（6）：403－414.

［3］Czinn S J，Blanchard T.Vaccinating againstHelicobacterpyloriinfection［J］.Nat Rev Gastroenterol Hepatol，2011，8（3）：133－140.

［4］方鐘，羅文新，夏寧邵.表位疫苗研究進(jìn)展［J］.中國(guó)生物工程雜志，2007，27（11）：86－91.

［5］Shi Y，Wu C，Zhou W Y，et al.Identification of H－2（d）restricted Th epitopes in Urease B subunit ofHelicobacterpylori［J］.Vaccine，2007，25（14）：2583－2590.

［6］Hirota K，Nagata K，Norose Y，et al.Identification of an antigenic epitope inHelicobacterpyloriurease that induces neutralizing antibody production［J］.Infect Immun，2001，69（11）：6597－603.

［7］Ha NC，Oh ST，Sung JY，et al.Supramolecular assembly and acid resistance ofHelicobacterpyloriurease［J］.Nat Struct Biol，2001，8（6）：505－509.

［8］林煥建，楊勤，李菁，等.過(guò)氧化氫酶和尿素酶B亞單位二價(jià)疫苗預(yù)防小鼠幽門(mén)螺桿菌感染［J］.南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，28（3）：436－437，443.

［9］李明峰，何志勇，凌貞，等.幽門(mén)螺桿菌 Hsp A和UreB雙價(jià)侯選疫苗株的構(gòu)建［J］.中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志，2000，20（3）：232－235.

［10］毛亞飛，嚴(yán)杰，徐颺.幽門(mén)螺桿菌內(nèi)置佐劑UreB和HpaA雙價(jià)重組疫苗對(duì)實(shí)驗(yàn)感染小鼠的免疫保護(hù)作用［J］.浙江大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2005，34（5）：405－411.

［11］曾韋錕，鄒全明，井申榮.幽門(mén)螺桿菌尿素酶B亞單位核酸疫苗的構(gòu)建及鑒定［J］.細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，2005，21（6）：665－667.

［12］徐燦，李兆申，屠振興，等.幽門(mén)螺桿菌UreB核酸疫苗的構(gòu)建［J］.第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，25（1）：51－54.

［13］袁小澎，鄒全明，洪愉，等.幽門(mén)螺桿菌雙亞單位基因疫苗的構(gòu)建及免疫原性研究［J］.中國(guó)免疫學(xué)雜志，2007，23（8）：684－687.

［14］劉秀麗，劉純杰，陶好霞，等.幽門(mén)螺桿菌重組腺病毒雙價(jià)疫苗的構(gòu)建及免疫學(xué)評(píng)價(jià)［J］.生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，2004，31（8）：716－721.

［15］Qiu Y，Wang YC，Tao HX，et al.Identification of B－cell epitopes in urease B subunit ofHelicobacterpyloribound by neutralizing antibodies［J］.Vaccine，2010，28（32）：5220－5227.

［16］Li HX，Mao XH，Shi Y，et al.Screening and identification of a novel B－cell neutralizing epitope fromHelicobacterpyloriUreB［J］.Vaccine，2008，26（52）：6945－6949.

［17］Zhou WY，Shi Y，Wu C，et al.Therapeutic efficacy of a multiepitope vaccine againstHelicobacterpyloriinfection in BALB/c mice model［J］.Vaccine，2009，27（36）：5013－5019.

［18］周維英，吳超，石云，等.幽門(mén)螺桿菌雙亞單位表位疫苗的構(gòu)建及免疫原性研究［J］.中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào)，2008，24（1）：33－37，66.

［19］Ermak TH，Giannasca PJ，Nichols R，et al.Immunization of mice with urease vaccine affords protection againstHelicobacter pyloriinfection in the absence of antibodies and is mediated by MHC class II－restricted responses［J］.J Exp Med，1998，188：2277－2288.