李少華 唐 康 張春梅 金伯泉 馬 櫻

(第四軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)部免疫學(xué)教研室，西安710032)

·專題綜述·

聯(lián)合T、B細(xì)胞表位設(shè)計(jì)多肽疫苗的研究進(jìn)展①

李少華②唐 康 張春梅 金伯泉 馬 櫻

(第四軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)部免疫學(xué)教研室，西安710032)

從Adam等[1]發(fā)現(xiàn)針對(duì)口蹄疫病毒的多肽疫苗，到Lerner[2]建立多肽疫苗合成的方法，再到聯(lián)合T、B細(xì)胞表位多肽疫苗設(shè)計(jì)的出現(xiàn)，新型疫苗的研制快速發(fā)展。聯(lián)合T、B細(xì)胞多肽表位是指將已證實(shí)或預(yù)測(cè)得到具有免疫原性的T、B細(xì)胞多肽表位通過生物、化學(xué)方法連接，或同時(shí)串聯(lián)通用CD4+T細(xì)胞表位以增強(qiáng)T、B細(xì)胞表位的免疫原性，從而形成的人工合成多肽表位。由于單一表位免疫原性弱，而聯(lián)合T、B細(xì)胞多肽表位可同時(shí)誘導(dǎo)體液免疫及細(xì)胞免疫應(yīng)答，因此成為目前多肽疫苗研究的熱點(diǎn)。國(guó)內(nèi)外應(yīng)用聯(lián)合多肽表位設(shè)計(jì)疫苗在抗感染及抗腫瘤等方面已有諸多報(bào)道，本文將對(duì)聯(lián)合多肽表位的選擇、連接方式、疫苗的設(shè)計(jì)以及在疾病模型中的研究和應(yīng)用等方面的進(jìn)展進(jìn)行全面綜述。

1 T、B細(xì)胞表位及通用Th細(xì)胞表位

1.1 T、B細(xì)胞表位 T細(xì)胞表位是指能與MHC分子結(jié)合并被T細(xì)胞受體(T cell receptor，TCR)識(shí)別從而激活特異性T淋巴細(xì)胞的一類多肽，分為CD4+T細(xì)胞表位和CD8+T細(xì)胞表位，前者一般為13～17個(gè)氨基酸的短肽，結(jié)合MHC Ⅱ 類分子，而后者一般為8～10個(gè)氨基酸的短肽，結(jié)合MHC Ⅰ 類分子。B細(xì)胞表位是指能被B淋巴細(xì)胞表面B細(xì)胞受體(B cell receptor， BCR)識(shí)別并能誘導(dǎo)其產(chǎn)生中和抗體的多肽，包括線性表位與構(gòu)象表位。其中B細(xì)胞以識(shí)別構(gòu)象表位為主，但由于技術(shù)的限制，目前人工篩選用于多肽疫苗的B細(xì)胞表位絕大部分為線性表位。

1.2 通用Th細(xì)胞表位 多肽疫苗具有特異性強(qiáng)、安全性高及容易保存等優(yōu)點(diǎn)，但也因免疫原性較弱、半衰期較短以及MHC限制性等因素影響了其免疫效果。Sinigaglia等[3]在1988年報(bào)道了一種來源于惡性瘧原蟲的蛋白多肽且能夠與多種人和鼠的MHCⅡ類分子結(jié)合從而激活多個(gè)克隆Th細(xì)胞的肽段，其序列為DIEKKIAKMEKASSVFNVVNS，并將這類較為保守的肽段命名為通用Th細(xì)胞表位。之后科學(xué)家們又陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了其他一些與通用Th細(xì)胞表位具有相似作用的多肽序列。1999年，美國(guó)聯(lián)合生物醫(yī)學(xué)公司根據(jù)通用Th細(xì)胞表位可作為多肽表位免疫刺激物的特性申請(qǐng)了專利。目前已應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)研究的主要通用Th表位有PADRE和破傷風(fēng)類毒素與白喉類毒素等。

1.2.1 PADRE 1994年，Alexander等[4]通過引入適當(dāng)?shù)腻^定殘基合成了6條十三肽，親和力分析以及一系列體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)合成的十三肽可具備不受MHCⅡ類分子，尤其是HLA-DR分子限制的能力，并且它們誘導(dǎo)T細(xì)胞應(yīng)答的能力是天然表位的一千倍以上。由于該組肽段中有兩條十三肽與HLA-DR、DQ親和力非常高，因此他們將這些合成肽段命名為泛DR表位(Pan DR epitope，PADRE)，并且預(yù)測(cè)了PADRE將在新型多肽疫苗的研制中具有重要的應(yīng)用前景。目前應(yīng)用較多的是序列AKFVAAWTLKAAA。

1.2.2 破傷風(fēng)類毒素與白喉類毒素 Diethelm-Okita等[5]在研究破傷風(fēng)類毒素上T細(xì)胞表位時(shí)，發(fā)現(xiàn)其中兩個(gè)表位肽能夠激活預(yù)先建立的任意一組T細(xì)胞克隆，隨后應(yīng)用隨機(jī)T細(xì)胞對(duì)破傷風(fēng)類毒素來源的兩個(gè)肽段以及白喉類毒素來源的7條肽段進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)這些肽段均具有相似的通用Th細(xì)胞表位功能，目前破傷風(fēng)類毒素來源的兩條肽段IDKISDVSTIVPYIGPALNI和NNFTVSFWLRVPKVSASHLET的應(yīng)用最為廣泛。另外，還有一些通用Th細(xì)胞表位應(yīng)用于某些病毒感染性疾病疫苗的設(shè)計(jì)中，例如HIV聯(lián)合表位肽疫苗設(shè)計(jì)中使用的pol711等[6]。

2 多肽抗原表位的連接方式

2.1 直接連接模式 直接將多個(gè)T細(xì)胞或B細(xì)胞表位首尾相連得到的串聯(lián)多肽表位，多采用CTL表位的N端連接B細(xì)胞表位C端，B細(xì)胞表位N端再連接通用Th細(xì)胞表位C端，中間可以重復(fù)連接。各表位之間以柔性linker如3～5個(gè)甘氨酸連接以防止新的抗原表位形成。該連接方法可以有效增強(qiáng)抗原多肽表位的免疫原性，同時(shí)又可以做到對(duì)各個(gè)抗原表位的準(zhǔn)確定量。但一般需要串聯(lián)30～40個(gè)以上的氨基酸才會(huì)具有較好的免疫原性[7]。

2.2 多抗原肽模式 Tam等[8]在1988年報(bào)道了將多個(gè)表位連接于多聚賴氨酸骨架的分支上從而獲得聯(lián)合多肽表位的方法。該連接方法可以使表位在空間上充分展開，不需載體即可顯著提高免疫原性，但合成費(fèi)用較高，如Liao等[9]在研究來源于人端粒逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)的表位肽連接時(shí)，將其中3個(gè)CTL表位分別連于賴氨酸骨架上，并在體外實(shí)驗(yàn)中證明其激發(fā)抗腫瘤免疫應(yīng)答的效果較線性表位更強(qiáng)。

2.3 脂肽模式 通過將各T、B細(xì)胞表位共價(jià)連接于具有佐劑活性的脂質(zhì)分子上從而構(gòu)建獲得多肽表位。脂質(zhì)分子穩(wěn)定且具有親脂性，該方法可使聯(lián)合表位獲得親脂性從而更容易進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，例如Wilkinson等[10]將脂質(zhì)佐劑、人表皮生長(zhǎng)因子2(HER-2)或黏蛋白1(MUC1)、PADRE以及腫瘤相關(guān)糖類抗原(TACA)串聯(lián)在一起構(gòu)建成為self-adjuvanting腫瘤糖肽疫苗，并在小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中證實(shí)該連接模式可優(yōu)化表位的排列，使其更容易被樹突狀細(xì)胞加工提呈。

2.4 表位基因重組表達(dá)模式 將編碼表位肽的核苷酸序列通過適當(dāng)?shù)姆绞酱?lián)起來，與細(xì)菌質(zhì)粒重組后，通過真核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)出重組多肽表位。該方法中序列的串聯(lián)需要保證每個(gè)編碼表位的基因序列可被正確閱讀、翻譯和有效終止，同時(shí)也需要選擇合適的表達(dá)載體和啟動(dòng)子。這種方式由于可以量產(chǎn)，也得到了廣泛的應(yīng)用，但步驟較多且需要進(jìn)一步純化[11]。

3 聯(lián)合多肽表位在多種疾病疫苗設(shè)計(jì)中的研究與應(yīng)用

3.1 在抗寄生蟲疫苗設(shè)計(jì)中的應(yīng)用 寄生蟲多肽疫苗的研究絕大多數(shù)是針對(duì)剛地弓形蟲與瘧原蟲的研究。聯(lián)合T、B細(xì)胞表位的疫苗設(shè)計(jì)在抗瘧原蟲中已有研究，例如Powell等[12]應(yīng)用惡性瘧原蟲蛋白上的T細(xì)胞表位、B細(xì)胞表位重復(fù)3次，與同源通用Th表位連接，末端再串聯(lián)20個(gè)賴氨酸殘基及一個(gè)酪氨酸殘基組成的21肽，最終獲得的肽段在以碳酸鈣為核心的微粒表面形成薄膜展開，稱之為layer-by-layer (LbL)微粒，用LbL免疫小鼠后測(cè)定中和抗體和特異性CTL，結(jié)果證實(shí)該肽段可誘導(dǎo)較強(qiáng)的免疫保護(hù)作用。El Bssati等[13]將組氨酸標(biāo)簽his-tag、CTL表位及多重卷曲肽段(包含PADRE)等連接在一起構(gòu)成能夠自我組裝成顆粒的肽段，用于設(shè)計(jì)針對(duì)剛地弓形蟲的多肽疫苗，在HLA-B*0702的轉(zhuǎn)基因小鼠中證實(shí)該肽段激活CD8+T細(xì)胞應(yīng)答的能力較強(qiáng)[13]。Mahajan等[14]在研究針對(duì)惡性瘧原蟲的多肽疫苗中，將瘧原蟲子孢子、紅內(nèi)期、紅外期T、B細(xì)胞表位采用不同的大量重復(fù)串聯(lián)方式構(gòu)建成為3種多抗原肽(MAP-1、2、3)，并證明這3種多抗原肽在小鼠體內(nèi)可不同程度抑制紅內(nèi)期瘧原蟲的生長(zhǎng)。

3.2 在腫瘤疫苗設(shè)計(jì)中的研究 在新型腫瘤疫苗的研究中，聯(lián)合多肽表位疫苗設(shè)計(jì)目前已有廣泛應(yīng)用，其中T、B細(xì)胞表位主要來源于腫瘤中人端粒逆轉(zhuǎn)錄酶hTERT、糖脂蛋白GLP、黏蛋白MUC以及HER-2分子等。PADRE等通用Th表位也應(yīng)用于串聯(lián)表位腫瘤多肽疫苗設(shè)計(jì)中，例如，Bettahi等[15]將來源于卵白蛋白的CTL表位、PADRE、糖類B細(xì)胞表位、棕櫚酸(PAM)連接并搭載于GLP上構(gòu)建針對(duì)小鼠B16黑素瘤的多肽疫苗OVA-GLP，在小鼠荷瘤模型中發(fā)現(xiàn)其可有效抑制腫瘤生長(zhǎng)。隨后用來源于HER-2的CTL表位替換卵白蛋白CTL表位，從而構(gòu)建成為HER-GLP-1線性GLP疫苗，并將PAM連接在CTL表位和PADRE之間得到具有分支結(jié)構(gòu)的HER-GLP-2疫苗分子，實(shí)驗(yàn)證實(shí)HER-GLP-1能更好地被樹突狀細(xì)胞提呈，并能刺激產(chǎn)生更高頻率的IFN-γ及更強(qiáng)烈的CTL應(yīng)答，而HER-GLP-2則能刺激B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生更高水平的特異性IgG，該研究結(jié)果對(duì)制備針對(duì)乳腺癌的多肽疫苗及其臨床治療都具有重要意義[16]。Cai等[17]將來源于MUC1的B細(xì)胞表位與破傷風(fēng)類毒素P2連接構(gòu)建聯(lián)合多肽表位，并與PAM連接，實(shí)驗(yàn)證實(shí)其在沒有佐劑輔助的情況下也能刺激小鼠產(chǎn)生針對(duì)MUC1的特異性抗體。Nezafat等[18]構(gòu)建了一種針對(duì)腎母細(xì)胞瘤(Wilms瘤)的新型聯(lián)合表位肽疫苗，將軟件預(yù)測(cè)獲得的分別來源于Wilms瘤和人乳頭瘤病毒(HPV) E7的兩種CTL表位、PADRE和破傷風(fēng)類毒素C段(TTFrC)連接，使用TLR4受體激動(dòng)劑肝磷脂血凝素作為佐劑，促使CD4+T細(xì)胞向Th1轉(zhuǎn)化，各肽段之間通過AAY及EAAAK等linker連接，通過對(duì)其3D結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其表面可形成多個(gè)線性及構(gòu)象B細(xì)胞表位，因此具備同時(shí)激活體液及細(xì)胞免疫應(yīng)答的能力。Mahdavi等[19]將來源于HER-2的T、B細(xì)胞表位連接并通過GLSP linker再連接一個(gè)來源于麻疹病毒的通用Th細(xì)胞表位，從而構(gòu)建得到針對(duì)乳腺癌的聯(lián)合多肽表位，免疫小鼠后體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)其誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答可有效抑制腫瘤細(xì)胞增殖。Wu等[20]將來源于人表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)的B細(xì)胞表位和來源于麻疹病毒的通用Th細(xì)胞表位編碼序列重組表達(dá)得到MVF-EGFR的嵌合肽段，并證實(shí)其在小鼠體內(nèi)可刺激產(chǎn)生針對(duì)EGFR的高滴度抗體。

盡管諸多研究已表明聯(lián)合多肽表位在腫瘤多肽疫苗的研究中具有一定的應(yīng)用前景，但目前大部分腫瘤多肽疫苗的設(shè)計(jì)還集中于CTL表位或B細(xì)胞表位串聯(lián)通用表位的研究，三者串聯(lián)構(gòu)建聯(lián)合多肽表位的應(yīng)用還有待深入研究。

3.3 在抗病毒疫苗研究中的應(yīng)用 應(yīng)用重組表達(dá)病毒抗原聯(lián)合多肽表位的方法，即通過選擇病毒多肽抗原表位，獲得其DNA序列，擴(kuò)增后插入質(zhì)粒，導(dǎo)入表達(dá)細(xì)菌得到目的肽段，如Kulkarni等[21]將分別來源于日本腦炎病毒(JEV)包膜蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白1的5種表位按B1TH1、B2TH3、B1TH2、TH3B1的組合方式連接，表達(dá)后得到肽段P-JEV即為針對(duì)JEV的聯(lián)合抗原表位。Li等[22]設(shè)計(jì)的針對(duì)JEV的多肽疫苗則包含PADRE，并且在肽段N端連接纖維蛋白溶酶原活化劑(TPA)以促進(jìn)肽段的溶解、分泌與折疊，同時(shí)連接CpG基序以增強(qiáng)多肽表位的免疫原性，最終形成包括PADRE、兩種T細(xì)胞表位以及4種B細(xì)胞表位的聯(lián)合多肽表位疫苗，實(shí)驗(yàn)證實(shí)其在小鼠體內(nèi)可誘導(dǎo)產(chǎn)生高滴度抗體與高水平T細(xì)胞應(yīng)答。Wei等[23]將針對(duì)甲型H1N1豬流感病毒的T、B細(xì)胞表位各兩個(gè)重組表達(dá)，并在兩個(gè)B細(xì)胞表位之間通過KK作為linker，在兩個(gè)T細(xì)胞表位之間通過RKR作為linker連接，在整個(gè)肽段的C端增加牛皰疹病毒1型的衣殼蛋白作為載體，實(shí)驗(yàn)證實(shí)在小鼠體內(nèi)可有效激發(fā)體液與細(xì)胞免疫應(yīng)答。Wang等[24]將6個(gè)B細(xì)胞表位、4個(gè)Th細(xì)胞表位以及兩個(gè)CTL表位插入2型皰疹病毒的糖蛋白D中，將其中的某些非表位肽段替換，應(yīng)用重組方法得到針對(duì)2型皰疹病毒的聯(lián)合多肽表位肽段，免疫小鼠后證實(shí)其誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答可降低感染率或減輕感染癥狀。

將病毒抗原的各T、B細(xì)胞表位直接連接獲得聯(lián)合表位多肽作為候選疫苗分子進(jìn)行免疫，也可誘導(dǎo)高水平的T細(xì)胞應(yīng)答及抗體產(chǎn)生。Monso等[25]設(shè)計(jì)的針對(duì)口蹄疫病毒(FMDV)的聯(lián)合多肽表位，先將四個(gè)B細(xì)胞表位并聯(lián)于T細(xì)胞表位形成B4T肽段，發(fā)現(xiàn)B4T誘導(dǎo)CD1小鼠產(chǎn)生中和抗體能力較強(qiáng)。隨后直接將兩個(gè)B細(xì)胞表位連接于三肽KKK再連接通用Th細(xì)胞表位即B2T，發(fā)現(xiàn)B2T誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的能力更強(qiáng)[26]。Kashi等[6]則是直接在病毒蛋白的適當(dāng)位置插入通用Th表位，如在HIV-1的反式激活蛋白(Tat)中富含Cys的結(jié)構(gòu)域和堿性結(jié)構(gòu)域中插入PADRE或Pol711，該方法既降低了Tat激活HIV基因轉(zhuǎn)錄的作用，也增強(qiáng)了其本身的免疫原性，免疫小鼠后證實(shí)Th1、Th2以及B細(xì)胞的免疫應(yīng)答均有所增強(qiáng)[6]。

3.4 在抗細(xì)菌多肽疫苗設(shè)計(jì)中的應(yīng)用 Mohamud等[27]構(gòu)建的重組卡介苗(rBCG)包括兩個(gè)多肽，rBCG018和rBCG032，前者將三種來源于Ag85B的T細(xì)胞表位連于Mtb8.4上，后者將來源于ESAT-6、CFP-10、MTP40蛋白的B細(xì)胞表位連于rBCG018，對(duì)rBCG與BCG誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的能力進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)rBCG誘導(dǎo)細(xì)胞免疫及體液免疫應(yīng)答的能力均強(qiáng)于BCG。Farjaha等[28]利用軟件預(yù)測(cè)得到來自銅綠假單胞菌的多肽序列，證實(shí)其既包含B細(xì)胞表位又包含T細(xì)胞表位，將藻朊酸鹽連接于該肽段，在小鼠肺炎模型中發(fā)現(xiàn)，用該肽段免疫后的小鼠發(fā)生急性肺炎的比例明顯下降。Lin等[29]將預(yù)測(cè)得到的鉤端螺旋體外膜蛋白OmpL1和LipL41的四個(gè)T、B細(xì)胞表位重組連接，免疫小鼠后發(fā)現(xiàn)CD4+T細(xì)胞，尤其是Th1細(xì)胞的應(yīng)答顯著增強(qiáng)。

需要注意的是，并非所有T、B細(xì)胞表位均可作為多肽疫苗設(shè)計(jì)的候選表位，例如在阿爾茨海默癥的研究中發(fā)現(xiàn)，針對(duì)Aβ的抗體有一定療效，而自身T細(xì)胞表位誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答則會(huì)引起不可逆的免疫病理損傷，因此在設(shè)計(jì)多肽疫苗時(shí)，可選用B細(xì)胞表位而不能選擇自身T細(xì)胞表位。這種情況下可采用B+T*表位方式，比如Ramirez-Gualito等[30]將來源于Tau蛋白的針對(duì)阿爾茨海默病的B細(xì)胞表位和來源于結(jié)核分枝桿菌Ag85B的T細(xì)胞表位用四肽GPSL連接起來形成β轉(zhuǎn)角得到28肽，實(shí)驗(yàn)證實(shí)該連接方法對(duì)各表位的免疫原性影響很弱。在設(shè)計(jì)針對(duì)登革病毒的多肽疫苗時(shí)，必須考慮到其特異性的抗體增強(qiáng)作用會(huì)導(dǎo)致巨噬細(xì)胞的感染加重，因此設(shè)計(jì)多肽疫苗時(shí)應(yīng)避免選擇其B細(xì)胞表位[31]，另外，在分析聯(lián)合多肽表位的免疫原性時(shí)，一般將單個(gè)T、B細(xì)胞表位作為對(duì)照，或者將T+T*表位、B+T*表位作為對(duì)照，評(píng)價(jià)T+B+T*表位誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的效果。

4 結(jié)語

雖然針對(duì)聯(lián)合T、B細(xì)胞表位多肽疫苗設(shè)計(jì)的研究已取得一定的進(jìn)展，但各種疾病抗原的多肽表位設(shè)計(jì)方法較為獨(dú)立，聯(lián)合T、B細(xì)胞表位多肽疫苗的設(shè)計(jì)研究尚缺乏較為實(shí)用的規(guī)律和標(biāo)準(zhǔn)。例如表位如何優(yōu)化選擇，多肽表位之間如何優(yōu)化連接等問題都有待進(jìn)一步解決。同時(shí)，多肽疫苗的研制還有賴于抗原表位基本研究的進(jìn)步，如優(yōu)勢(shì)T、B細(xì)胞表位的鑒定，更加有效的通用Th細(xì)胞表位的篩選以及合適的佐劑與運(yùn)載體的應(yīng)用等，均需要更深入的研究與探討。

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[收稿2016-01-28 修回2016-03-05]

(編輯 倪 鵬)

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.01.029

①本文受國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目(81401297)、陜西省自然科學(xué)基礎(chǔ)研究計(jì)劃青年人才項(xiàng)目(2015JQ8295)資助。

李少華(1996年-)，男，主要從事抗感染免疫研究，E-mail:330321697@qq.com。

及指導(dǎo)教師：馬 櫻(1984年-)，女，博士，講師，主要從事抗感染免疫研究，E-mail：merry_bg20@163.com。

R392.3

A

1000-484X(2017)01-0136-04

②第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)員旅五營(yíng)十七連，西安710032。