小克銀漢霉屬微生物模型在體外藥物代謝研究中的應(yīng)用

任麗艷，關(guān) 瑾，陳 星，王慧澤

(沈陽(yáng)化工大學(xué)應(yīng)用化學(xué)學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110142)

藥物代謝即藥物的生物轉(zhuǎn)化，是指藥物在生物體內(nèi)發(fā)生的有機(jī)化學(xué)反應(yīng)，主要是指“脫毒”反應(yīng)。藥物經(jīng)代謝后通常發(fā)生結(jié)構(gòu)變化，從而引起相應(yīng)的藥理活性及毒性改變。通過(guò)藥物代謝研究，可以闡明藥物代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)，確定藥物生物轉(zhuǎn)化過(guò)程的代謝酶，評(píng)價(jià)母體藥物和代謝產(chǎn)物的藥理學(xué)、藥代動(dòng)力學(xué)和毒理學(xué)性質(zhì)等，為進(jìn)一步改造藥物的化學(xué)結(jié)構(gòu)，開(kāi)發(fā)新藥提供依據(jù)和研究思路［1-2］。

目前藥物代謝研究主要有體內(nèi)和體外2種方法。體內(nèi)代謝法可以綜合考慮各種體內(nèi)因素對(duì)藥物的影響，能夠真實(shí)全面地反映藥物代謝的體內(nèi)特征。體外代謝法可在短時(shí)間內(nèi)得到大量的代謝產(chǎn)物，可以方便控制代謝條件，易于對(duì)代謝產(chǎn)物進(jìn)行分離和提取，盡快確定代謝途徑及結(jié)構(gòu)變化［3］。目前常用的體外代謝方法主要有肝細(xì)胞培養(yǎng)法、肝組織切片法、肝灌流法和肝微粒法。這些方法操作繁瑣，技術(shù)要求較高［4-6］。另外，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，可利用基因重組表達(dá)的細(xì)胞色素P450(cytochrome P450，CYP450)酶系中的某個(gè)純酶進(jìn)行藥物代謝研究，但目前各種純酶的商品價(jià)格非常昂貴，在一定程度上限制了重組藥物代謝酶的應(yīng)用［7］。利用微生物轉(zhuǎn)化為藥物體外代謝模型則具有很多優(yōu)勢(shì)，本文對(duì)其在藥物代謝方面的應(yīng)用進(jìn)行綜述。

1 模擬哺乳動(dòng)物藥物代謝的微生物模型

1973年，Smith等［8］通過(guò)實(shí)驗(yàn)最先提出了“建立模擬哺乳動(dòng)物代謝的微生物模型(microbial models of mammalian metabolism)”的概念，其核心內(nèi)容是:真菌和哺乳動(dòng)物均為真核生物，因此它們?cè)谀承┥磻?yīng)中有類(lèi)似的酶或酶系參與?；谶@一理論，利用微生物作為模型研究哺乳動(dòng)物的藥物代謝得到了廣泛的應(yīng)用。

與藥物代謝的體內(nèi)和體外研究方法相比較，利用微生物作為藥物代謝研究的模型具有很多優(yōu)勢(shì)［9］:①通常情況下微生物和人體代謝途徑的相似性并不亞于哺乳動(dòng)物和人，因此可以采用微生物模型模擬人體藥物代謝，推測(cè)或輔助證實(shí)哺乳動(dòng)物體內(nèi)的藥物代謝途徑，從而大量減少實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和實(shí)驗(yàn)成本。②微生物來(lái)源廣泛，種類(lèi)繁多，可提供大量的篩選模型。③可調(diào)節(jié)，通過(guò)優(yōu)化條件，可顯著提高目的代謝產(chǎn)物的收率，有助于檢測(cè)和制備毫克級(jí)甚至納克級(jí)代謝產(chǎn)物對(duì)照品并進(jìn)行藥理學(xué)與毒理學(xué)研究。④建立微生物轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，成本低，操作簡(jiǎn)單，易于控制。Foster等［10］研究發(fā)現(xiàn)，奎尼丁和金雀花堿抑制班氏小克銀漢霉(Cunninghamella bainier)對(duì)普羅帕酮及甲氧那明(甲氧苯丙甲胺)的轉(zhuǎn)化，與人體內(nèi)的代謝過(guò)程十分類(lèi)似，提示真菌中具有與人體類(lèi)似的藥物代謝酶，并且可以用于藥物間相互作用的研究。Davila等［11］通過(guò)研究刺孢小克銀漢霉(Cun.echinulata)對(duì)罌粟堿的轉(zhuǎn)化發(fā)現(xiàn)，利用該菌株可以評(píng)價(jià)藥物的毒性。Asha等［12］對(duì)各類(lèi)細(xì)胞色素酶進(jìn)行了介紹并對(duì)其各自作用的底物進(jìn)行了總結(jié)，以真核微生物小克銀漢霉屬(Cunninghamella Matruchot)為例提出了微生物技術(shù)手段在未來(lái)的應(yīng)用。這些研究結(jié)果表明真菌模型在藥物代謝研究中具有更為廣泛的用途。

2 真菌細(xì)胞色素P450

1958 年，Klingenberg［13］和 Garfinkel［14］首次發(fā)現(xiàn)一種能與一氧化碳結(jié)合的色素，Omura等［15］發(fā)現(xiàn)它是一種性質(zhì)特殊的血紅蛋白，其還原態(tài)可與一氧化碳結(jié)合，在波長(zhǎng)450 nm處有明顯吸收峰，因而于1962年首先提出CYP450這一名稱(chēng)，又稱(chēng)其為混合功能氧化酶(mixed function oxidase，MFO)或單加氧酶(monooxygenase)。后陸續(xù)發(fā)現(xiàn)CYPs是參與外源化合物解毒和內(nèi)源化合物代謝的重要酶系，主要位于細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，和藥物代謝的Ⅰ相反應(yīng)，和大部分臨床藥物的代謝。

真菌，尤其是絲狀真菌對(duì)許多藥物的轉(zhuǎn)化反應(yīng)都是由CYP450介導(dǎo)的，通過(guò)使用一些經(jīng)典的CYP酶抑制劑，如美替拉酮或一氧化碳等對(duì)轉(zhuǎn)化反應(yīng)的抑制作用，已經(jīng)間接證明了微生物和(或)真菌CYP酶參與了轉(zhuǎn)化反應(yīng)［16-17］。小克銀漢霉屬是一類(lèi)絲狀真菌，根據(jù)形態(tài)及生理特征共分為5種:刺孢(短刺)小克銀漢霉，班氏小克銀漢霉，布氏小克銀漢霉，巴西果小克銀漢霉和綺麗(雅致)小克銀漢霉。Amadio等［18］以氟比洛芬(flurbiprofen)為底物對(duì)小克銀漢霉屬不同種類(lèi)進(jìn)行了考察，結(jié)果表明小克銀漢霉屬具有與人體類(lèi)似的藥物代謝酶。Wang等［19］利用真菌線粒體的單克隆抗體從雅致小克銀漢霉的cDNA文庫(kù)中篩選編碼473個(gè)氨基酸殘基的全長(zhǎng)cDNA，并利用E.coli實(shí)現(xiàn)了過(guò)量表達(dá)，免疫印跡實(shí)驗(yàn)表明哺乳動(dòng)物CYP1A，CYP2E1和CYP3A1的抗體與表達(dá)蛋白呈陽(yáng)性反應(yīng)，這些研究從另一個(gè)角度說(shuō)明該菌株具有與人體十分類(lèi)似的CYP450。

3 小克銀漢霉屬微生物模型在體外藥物代謝中的應(yīng)用

小克銀漢霉菌屬的許多菌株具有與人體類(lèi)似的Ⅰ相和Ⅱ相藥物代謝酶［20］，在模擬人體的藥物代謝研究方面得到廣泛的應(yīng)用。以下以幾種常用的小克銀漢霉屬微生物模型為例，介紹其在體外藥物代謝中的一些應(yīng)用。

3.1 短刺小克銀漢霉屬AS3.153模型在藥物代謝中的應(yīng)用

哈爾明堿(harmine)具有抗腫瘤作用，但其毒性較大，中毒劑量和最大安全劑量接近，因此有必要對(duì)哈爾明堿及其代謝產(chǎn)物的活性和毒性等方面進(jìn)行研究，以探索能否找到增加其生物活性同時(shí)降低毒性的產(chǎn)物。邱彬等［21］應(yīng)用短刺小克銀漢霉(Cun.blakesleeane)AS3.153對(duì)哈爾明堿的代謝轉(zhuǎn)換進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，該菌株對(duì)哈爾明堿的代謝轉(zhuǎn)化率高，能夠特異性地制備哈爾明堿的氧去甲基化產(chǎn)物和芳環(huán)上的羥基化產(chǎn)物，并進(jìn)行了結(jié)構(gòu)鑒定。到目前為止，有關(guān)哈爾明堿在人體或動(dòng)物的代謝轉(zhuǎn)化的報(bào)道較少，且由于通過(guò)體內(nèi)代謝得到的產(chǎn)物量少，難以進(jìn)行下一步研究。而藥物微生物轉(zhuǎn)化有利于制備足量的代謝產(chǎn)物，為進(jìn)一步的藥物結(jié)構(gòu)鑒定及其藥理毒理研究奠定基礎(chǔ)。由于短刺小克銀漢霉AS3.153在藥物代謝過(guò)程中轉(zhuǎn)化率高，故其微生物代謝模型廣泛應(yīng)用于藥物。目前已應(yīng)用該微生物模型進(jìn)行代謝研究的藥物有:維拉帕米［22］、昂丹司瓊［23］、苯丙哌林［24］、萘普生［25］、異戊他定［26］、泮托拉唑［27］、美托洛爾［28］和右美沙芬［29］等。

3.2 短刺小克銀漢霉AS3.910模型在藥物代謝中的應(yīng)用

“馬兜鈴酸腎病”是近幾年來(lái)在國(guó)際上引起廣泛關(guān)注的一類(lèi)由于中草藥的不良反應(yīng)而導(dǎo)致腎損害。由于馬兜鈴酸類(lèi)化合物在體內(nèi)代謝比較復(fù)雜，代謝產(chǎn)物又難以收集，給這類(lèi)化合物代謝物的毒理學(xué)研究造成了很大的障礙。郭永超等［30］選用短刺小克銀漢霉AS3.910用微生物轉(zhuǎn)化的方法對(duì)馬兜鈴酸A進(jìn)行了代謝轉(zhuǎn)化研究并比較了微生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物和哺乳動(dòng)物體內(nèi)代謝產(chǎn)物的異同。短刺小克銀漢霉AS3.910可對(duì)馬兜鈴酸A進(jìn)行專(zhuān)一性的氧去甲基化作用的結(jié)構(gòu)改造而獲得代謝產(chǎn)物，在與Krumbiegel等［31］進(jìn)行的動(dòng)物體內(nèi)代謝產(chǎn)物進(jìn)行比較后，證明該化合物是馬兜鈴酸A在哺乳動(dòng)物體內(nèi)代謝產(chǎn)物之一。經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化，可以穩(wěn)定、方便地獲得這一目標(biāo)代謝物，作為標(biāo)準(zhǔn)品，從而方便了對(duì)該目標(biāo)代謝物的制備及其毒理和藥理學(xué)方面的研究。楊秀偉等［32］用短刺小克銀漢霉AS3.910建立了具有CYP2C9活性的微生物模型。通過(guò)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基的種類(lèi)和初始pH，使轉(zhuǎn)化系統(tǒng)在較高底物濃度下具有良好的轉(zhuǎn)化效果，格列本脲、雙氯芬酸和吲哚美辛總轉(zhuǎn)化率分別為90%，100%和83%，而且形成的主要轉(zhuǎn)化產(chǎn)物與人體CYP2C9產(chǎn)生的主要代謝產(chǎn)物相同。

3.3 雅致小克銀漢霉AS3.156模型在藥物代謝中的應(yīng)用

萘普生是常用的非甾體類(lèi)抗炎藥物，用于治療風(fēng)濕或某些非風(fēng)濕性疾病引起的疼痛與炎癥。該藥在人體和動(dòng)物體內(nèi)的代謝途徑主要包括:①萘環(huán)C-6位甲氧基發(fā)生去甲基反應(yīng)生成O-去甲基萘普生;② 母體藥物通過(guò)羧基與葡萄糖醛酸或甘氨酸結(jié)合;③ O-去甲基萘普生通過(guò)酚羥基與葡萄糖醛酸結(jié)合［33］。劉磊等［34］采用雅致小克銀漢霉(Cun.elegans)AS3.156對(duì)萘普生的微生物轉(zhuǎn)化進(jìn)行了研究。雅致小克銀漢霉AS3.156可高度專(zhuān)一性地轉(zhuǎn)化萘普生形成O-去甲基萘普生，且產(chǎn)率高達(dá)95%以上。

4 展望

小克銀漢霉屬的許多菌株具有與人體類(lèi)似的Ⅰ相和Ⅱ相藥物代謝酶，現(xiàn)在已應(yīng)用于體外藥物代謝研究中。微生物轉(zhuǎn)化法具有易調(diào)節(jié)、易放大等特點(diǎn)，通過(guò)選擇比較理想的轉(zhuǎn)化菌株和優(yōu)化調(diào)節(jié)可以強(qiáng)化某些轉(zhuǎn)化途徑，用于較大規(guī)模地制備一定數(shù)量的代謝物純品，確定其化學(xué)結(jié)構(gòu)與生物學(xué)活性，為體內(nèi)藥物代謝產(chǎn)物的深入研究奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。但由于其尚不能全面反映體內(nèi)代謝的綜合情況，與生物體內(nèi)的真實(shí)情況存在一定的差異及菌株成本較高，使得這種方法制備的代謝產(chǎn)物對(duì)照品非常昂貴，其廣泛的應(yīng)用受到一定的限制。

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